惰性載體對瘤胃真菌產酶活性的影響畢業(yè)論文(編輯修改稿)
2025-10-03 13:54 本頁面
【文章內容簡介】 ），溶解后再依次加入已稱量好的 3,5二硝基水楊酸 g、氫氧化鈉 g、重結晶苯酚 g，無水亞硫酸鈉鹽 g，用玻璃棒攪拌至完全溶解，冷卻后定容至 1000 mL棕色容量瓶內，避光保存，放置一周后取上清液使用。 成分 Composition 碳酸氫鈉 NaHCO3 葡萄 糖 Glucose 酵母膏 Yeast cream 蛋白胨 Pepton 緩沖液 A Buffer A 緩沖液 B Butter B 無細胞瘤胃液 Cellfree rumen fluid 蒸餾水 Distilled water 含量 g g g g 165 mL 165 mL 170 mL 500 mL 7 菌種擴繁 菌種活化 將保存在 20℃ 中的 B 菌種平板培養(yǎng)基取出，置于 39℃ 下解凍備用。在超凈臺中進行無菌接種，右手取接種環(huán)在酒精火焰上灼燒滅菌，先將環(huán)燒熱至發(fā)紅，然后將整個細金屬絲燒紅，再將接種環(huán)傾斜，沿 著環(huán)向上依次燒，直到燒至可能碰到培養(yǎng)基的部分，如此返回在燒到環(huán)端，來回通過火焰數次。待接種環(huán)自然冷卻（或蘸取平板內水珠冷卻）后，刮取 已在室溫下解凍的平板上的菌落，左手持瓊脂平板，在靠近酒精燈火焰 處 略開蓋。右手持已取標本的接種環(huán)伸入到瓊脂平板表面一側邊緣，利用腕力將接種環(huán)在平板上來回劃線。 傳代培養(yǎng) 上述菌株培養(yǎng)三天后，進行菌體傳代擴繁。將已配好的 2 L 液體種子培養(yǎng)基分別均分于 10 個 1725 cm封口袋中（即每袋 200 mL），再把已活化的菌 接種到封口袋中，仍置于39℃ 的溫箱中進行傳代培養(yǎng) 3 天， 觀察菌體生長情況，此操作依舊需要在超凈臺中進行。菌體一般傳 3 代后可滿足試驗需要量。 試驗設計 本試驗采用二因素試驗設計，載體類型為珍珠巖、沸石、膨潤土，載體添加量分別 %、%、 %。 試驗方法及酶活測定 每個固態(tài)培養(yǎng)基重 200 g，其中添加固態(tài)底物 80 g，其余為水分（包含菌體培養(yǎng)液）。固態(tài)底物和已與菌體培養(yǎng)液 20 mL 混合的載體混合 物拌勻 后裝袋，經抽真空后置于 39℃ 溫箱中發(fā)酵，每隔 2 天采樣測酶活。取固態(tài)培養(yǎng)物 1 g 左右于 15 mL 離心管中，用移液槍向離心管中加入 10 mL pH= 的檸檬酸 磷酸氫二鈉緩沖液，震蕩混勻后，靜置 30 min，然后置于 4000 r/min 高速離心機離心 30 min，取上清液于 10 mL 離心管中，置入 4℃ 的冰箱中冷藏備用，測定其中的羧甲基纖維素酶 （ Carboxymethyl cellulose, CMC）、微晶纖維素酶（ Microcrystalline cellulose, MCC）、 β葡萄糖苷酶（ βglucosidase, BGL）、濾紙酶（ filter paper enzyme, FPA） 活性。 羧甲基纖維素酶（ CMC）活性測定 葡萄糖標準曲線的繪制參照朱崇淼等 [5]的方法稍加改進，分別稱取已經烘干恒重的葡萄糖 g、 g、 g、 g、 g，分別溶于 5 個 25 mL 的小容量瓶中，配成用于繪制標準曲線的葡糖糖標準溶液，然后分別再取 mL上述標準溶液于 10 mL 離心管中，空白組加入 mL 蒸餾水代替標準溶液，再向每個離心管中加入 1 mL 蒸餾水和 mL 緩 8 沖液，混勻后置于 50℃ 水浴中加熱 5 min，最后加入 3 mL DNS 溶液，沸水浴 5 min 后迅速置于冷卻，將紫外分光光度計設置在 550 nm 波長處測取吸光值。繪制標準曲線，如圖 1。 本試驗參照 Lowe 等 [8]方法稍加改良，取已配好的羧甲基纖維素鈉（ CMC）溶液 1 mL于 10 mL 離心管中，再加入 mL pH= 的檸檬酸 磷酸氫二鈉溶液，置于 50℃ 水浴鍋預熱 5 min 后，后加入稀釋 10 倍的發(fā)酵液 mL，混合均勻， 50℃ 水浴加熱 30 min 后，加入 DNS 溶液 3 mL，沸水浴 5 min 后迅速置于冷水冷卻，置 550 nm 波長讀取吸光值。對照組發(fā)酵液上清液經煮沸滅活后作對照。以葡萄糖標準曲線為標準，計算所測的上清液釋放的葡萄糖具體 含量。酶活力定義為在上述條件下，每分鐘釋放 1 μmol 葡萄糖的酶量為一個酶活單位（ U），換算成每 克 干物料含有的酶活，以 U/g（干物質）。 酶活力計算： 酶活力 (U/g)=WN1000/(TmM)。 W酶解反應產生得葡萄糖量，從葡萄糖標準曲線上查得，單位： g； T反應時間， 30 min； N酶液得稀釋倍數； 50 M葡萄糖分子量， g/mol； m樣品干物質質量， g。 微晶纖維素酶 (MCC)活性的測 定 本試驗此方法根據 Hossam M[9]的方法改良。取 1 mL 微晶纖維素的溶液于 10 mL 離心管中，加入 mL pH= 檸檬酸 磷酸氫二鈉緩沖液， 50℃ 水浴預熱 5 min 后，加入 mL稀釋 10 倍的發(fā)酵液上清， 50℃ 水浴保溫 30 min 后，加 3 mL DNS 溶液， 100℃ 沸水浴 5 min顯色冷卻后，置于紫外可見光光度計中 550 nm 波長讀取吸光值，對照組以經煮沸滅活的發(fā)圖 1 葡萄糖標準曲線 Standard curve of glucose y = 0 . 0 8 9 5 xR 178。 = 0 . 9 9 800 . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 1 2 3 4 5 6葡萄糖含量（g）吸光值 9 酵液上清作對照，然后以葡萄糖標準曲線為標準，計算所測上清液釋放的葡萄糖含量。酶活力的定義同上文所述的羧甲基纖維素酶。 β葡萄糖苷酶 (BGL)活性測定 取 1 mL 水楊素溶液于 10 mL 離心管中，加入
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