【文章內容簡介】 nd Ackrill，1993；Faa and Crisponi，1999），它也是鐵載體。但是它有一系列的副作用（Dexter et al.，1999；Kontoghiorghes，1995；Martell et al.，1999），所以有人想利用天然產(chǎn)生的鐵載體（Bergeron et al.，1994；Peterson et al.，1976）和人工合成的鐵載體類似物（Dexter et al.，1999；Hershko et al.，1998；Martell et al.，1999）作為治療Fe和Al過量的口服DFO的有效替代物，從而來治療這些疾病。通過對5個地中海貧血癥病人的靜脈注射真菌異羥肟酸類鐵載體——紅酵母酸，取得了一定療效。但是在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，口服紅酵母酸并沒用明顯效果。鐵載體在實際應用中的另一個被人關注的地方就是它對錒系元素的溶解性（Brainard et al.，1992）。錒系元素具有放射性，不僅是是潛在的致癌物，而且還會對環(huán)境造成放射性污染。利用鐵載體的該性質，可以治療錒金屬中毒（Faa and Crisponi，1999；Loyevsky et al.，1993； Stradling，1998；Weinberg，1999），亦或是利用鐵載體處理含錒系元素的放射性污水。2不同培養(yǎng)基中海洋普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans） 海洋普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans）。其改造菌株R6敲除了SreA基因。該基因在周圍環(huán)境鐵離子充足的情況下可以抑制鐵載體合成。因此，改造菌株的鐵載體合成受周圍環(huán)境中鐵濃度的影響較小。為了衡量天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基之間哪個更有利于鐵載體產(chǎn)生，并以Csaky試驗法測量鐵載體濃度。以此選出最適宜菌株產(chǎn)鐵載體的培養(yǎng)基，為下一步實驗做準備。根據(jù)相關資料，產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基加入L鳥氨酸后鐵載體的產(chǎn)量明顯增加。因此本次實驗也對天然培養(yǎng)基加入了L鳥氨酸，以此來測試L鳥氨酸是否對天然培養(yǎng)基也有同樣的效果。（敲除了SreA基因，其鐵載體產(chǎn)量受周圍環(huán)境中鐵濃度的影響減弱）1N H2SO4溶液醋酸鈉溶液（Sodiun zcetate）: 35g醋酸鈉晶體溶于100mL蒸餾水中對氨基苯磺酸(Sulfanilic acid):1g對氨基苯磺酸溶于100mL，30％（v/v）的乙酸中，加熱溶解。碘溶液（Iodine solution）:硫代硫酸鈉溶液：α萘胺（αNaphthylamine solution）:3gα萘胺溶于100mL，30％的乙酸中1M L鳥氨酸豆餅粉水解液配置：稱取32g豆餅粉，溶解于250ml 。110℃滅菌20min,。10000rpm離心5min，取上清液用濾紙過濾。用蒸餾水將濾液定容至800ml。分裝于塑料瓶中冷凍備用。YPD培養(yǎng)基（w/v）：%，%，%，%瓊脂粉。麥芽汁培養(yǎng)基（w/v）：%，％，pH 豆餅粉水解液培養(yǎng)基（w/v）：%，豆餅粉水解液配制，pH 產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基（w/v）：%，(NH4)2SO4 %，K2HPO4 %，檸檬酸 %，MgSO4 %，ZnSO4 %，pH 。配制過程中所用的玻璃器皿都經(jīng)過6 N的HCl溶液浸泡過夜，用三蒸水沖洗，去除容器上附著的痕量鐵，以避免其對實驗引起干擾將菌種接于YPD培養(yǎng)基，在28℃下培養(yǎng)48h。 mL各培養(yǎng)基中，在30℃和180 rpm下振蕩培養(yǎng)24h，即為種子液。取一定量的種子液接入裝有50ml各種培養(yǎng)基的250ml三角瓶中（）。在28℃下，180rpm搖床培養(yǎng)120h。其它培養(yǎng)條件按實驗要求進行。（Csaky試驗法）（1）取1mL待測液，加1mL1N的H2SO4,130℃下處理30min或沸水浴6h（2）加入3 mL醋酸鈉（3）取上述反應液1 mL，加4 mL蒸餾水（4） mL碘溶液（5）室溫下放置57min（6） mL硫代硫酸鈉去除多余碘（7），顯色2030min后測520nm處吸光度（8）經(jīng)標準曲線y=+，可得羥胺濃度，在28℃下培養(yǎng)48h，以活化菌種。、麥芽汁培養(yǎng)基、豆餅粉水解液培養(yǎng)基和產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基上，28℃和180rpm下振蕩培養(yǎng)24h，作為種子液。將裝有50ml各種培養(yǎng)基的250ml三角瓶分為兩組，每一組均是由YPD培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、豆餅粉水解液培養(yǎng)基、產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基組成。其中一組每瓶中加入500uL的 L鳥氨酸，另一組則不加。將種子液分別接種于兩組培養(yǎng)基中（），在28℃下，180rpm搖床培養(yǎng)120h。，12000rpm下離心5min。分別測量上清液羥胺濃度，并根據(jù)稀釋倍數(shù)換算為鐵載體濃度，相互比較。經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)并處理后，測量520nm處的吸光度值。從圖21,22中我們可以看出產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基相比于其他天然培養(yǎng)基更有利于菌種生產(chǎn)鐵載體。同時我們將加L鳥氨酸組和未加L鳥氨酸的相同培養(yǎng)基的鐵載體產(chǎn)量相比較，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基在加入L鳥氨酸后，鐵載體產(chǎn)量明顯增加，這與已知結論相符。而各種天然培養(yǎng)基加入L鳥氨酸后鐵載體產(chǎn)量增加則不明顯（圖23,24）。由此可見L鳥氨酸對天然培養(yǎng)基效果不大。圖21未加入L鳥氨酸的鐵載體濃度Figure 21 Siderophore concentration without Lornithine 圖22加入L鳥氨酸的鐵載體濃度Figure 22 Siderophore concentration with LornithineData are given as means 177。 SD, n=3.經(jīng)過以上一系列實驗，從圖21中我們可以清晰的看出，菌體在產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中的鐵載體產(chǎn)量遠遠大于在其他培養(yǎng)基中的產(chǎn)量；從圖22中可以看出產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基在加入了L鳥氨酸后，菌株的鐵載體產(chǎn)量明顯增加，而L鳥氨酸則對各種天然培養(yǎng)基中菌株的鐵載體產(chǎn)量影響不大。由圖12我們可以知道，L鳥氨酸是鐵載體合成的原料之一，因此加入L鳥氨酸有利于鐵載體的合成。而在天然培養(yǎng)基中，菌體可利用的鐵較為充足，因此鐵載體的合成不旺盛，L鳥氨酸的影響也就相對較小。我們發(fā)現(xiàn)加入L鳥氨酸的產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基最有利于鐵載體合成。因此我們選用產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基和菌株R6進行下一步的擴大化培養(yǎng)。3菌株的擴大化培養(yǎng)如上所述，在擴大化培養(yǎng)的中，我們使用加入L鳥氨酸的產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基在2L發(fā)酵罐進行發(fā)酵。發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵罐轉速為200rpm。為了獲得最佳的培養(yǎng)時間，我們每個12h進行一次取樣，以測量發(fā)酵罐中的菌體生長情況和鐵載體產(chǎn)量。 實驗材料與試劑 菌株?？捡R斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)：稱取100μg考馬斯亮藍G－250，溶于50 m