【文章內(nèi)容簡介】 (Staphylocous aureus AS )、枯草芽 孢 桿菌 (Bacillus subtilis)、 釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 紅酵母 (Rhodotorula sp.)、 青霉 (Penicillium sp.)、 黑曲霉 (Aspergillus niger)。 以上供試菌種均由本研究室保存 。 培養(yǎng)基 [18] 銀杏內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基 ： 水瓊脂培養(yǎng)基 (瓊脂 20g， 水 l000ml)； 孟加拉紅培養(yǎng)基(分別在 PDA、 CMA、 SDA、 YEA 培養(yǎng)基中加入孟加拉紅使其終濃度達(dá) 40PPm)； PDA： 馬鈴薯 200 g， 葡萄糖 20 g， 瓊脂 20g， 水 1000ml， 自然 pH， 121℃ 、 20min滅菌 ； 液體 PD 不含瓊脂 ； CMA： 玉米粉 40g， 蔗糖 10g， 瓊脂 20g， 水 l000ml， 自然 pH， 121， C、 20min滅菌 ； SDA： 蛋白陳 10g， 麥芽糖或葡萄糖 40g， 瓊脂 15g， 水 1000ml， 調(diào) 節(jié) ， 121℃ 、20min 滅菌 ； YEA： 酵母膏 5g， 葡萄糖 20g， 硫酸錢 ， 磷酸二氫錢 ， 瓊脂 12g， 水1000ml， 調(diào) 節(jié) ， 121℃ 、 20min 滅菌 ； 查氏培養(yǎng)基 ： 蔗 20g， 硝酸鈉 3g， 氯化鉀 ， 硫酸亞鐵 ， 磷酸氫二鉀 1g，硫酸鎂 ， 水 1000ml， 瓊脂 15g。 121℃ 、 15min 滅菌 ； 麥芽培養(yǎng)基 ： 麥芽糖 ， 糊精 ， 甘油 ， 蛋白陳 ， 瓊脂 15g，水 1000ml， 調(diào) 節(jié) pH 至 。 12l℃ 、 15min 滅菌 ； 細(xì)菌培養(yǎng)基 ： 肉湯培養(yǎng)基 (牛肉膏 3g， 蛋白陳 10g， 氯化鈉 5g， 瓊脂 12g， 水 1000ml， 一 )； . 主要儀器設(shè)備 全溫?fù)u瓶柜 — 太倉實(shí)驗設(shè)備廠 生化培養(yǎng)箱 — 上海益恒實(shí)驗設(shè)備有限公司 潔 凈工作臺 — 蘇凈集團(tuán)安泰公司 數(shù)顯恒溫水浴鍋 — 國華電器有限公司 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 8 電泳儀 — 北京六一儀器廠 分光光度計 — HITACHI 離心機(jī) — 上海安亭科學(xué)儀器廠 PCR 儀 — 真空冷凍干燥儀 — 德國 CHRIST 公司 電熱手提式壓力蒸汽消毒器 — 上海醫(yī)用核子儀器廠 生物顯微鏡 — 尼康 H60OL 掃描式電子顯微鏡 ， HnACHI . 主要試劑 （ 1） 10%SDS()： 90ml 水中加入 10g 電泳級十二烷基磺酸鈉 (SDS)， 加熱至 68℃助溶 ， 用 Na0H 調(diào) ， 加水定容至 100ml。 （ 2） 氯化芐 法抽提液 (100mmol/LTris 一 HCI， ； 40mmnol/LEDTA， )先配制母液 ： 500mmol/L TrisHCI()： 在 80ml 水中加入 三輕甲基氨基甲烷 (Tris)， 溶解后用稀鹽酸調(diào) ， 定容至 100ml， 滅菌備用 。 500mmol/L EDTA（ ) ： 在 80ml 水中加入 乙二胺四乙酸二鈉 ( Na2 EDTA2H2O)， 用 NaOH(約 2g)調(diào) 加水定容至 100ml， 滅菌備用 。 抽提液配制 ： 于 60ml 水中加入 20ml 500mmol/L Tris 一 HCI()和 8ml 500mmol/L EDTA()加水定容至 100ml。 (3)3mol/LNaAC()： 80ml 水中加入 無水乙酸鈉 (NaAC)， 調(diào) ， 加水定容至 100ml， 滅菌備用 。 (4)苯酚 ： 氯仿 ： 異戊醇 (25： 24： 1， V/V) (5)乳酸石炭酸 ： 稱取乳酸 (比重 )20g、 石炭酸 20g、 甘油 (比重 )40g、 蒸餾水 20ml。配制時先將石炭酸加熱溶解 ， 倒入水中 ， 再慢慢加入乳酸和甘油 。 (6)戊二醛溶液 ： 稱取戊二醛溶解于 PBS()中 ， 25℃ 放置 4h 配制成 30g/L的溶液 ； (7)氯化 芐 、 異丙醇 、 無水乙醇 、 二 氯 化汞 (升汞 )為分析純試劑 。 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 9 實(shí)驗方法 樣品表面消毒處理為 ： %升汞溶液浸泡 lmin→ 無菌水沖凈 → 70%酒精浸泡 lmin → 無菌水沖凈 → 酒精燈火焰灼燒 10s。 將樹枝樣品鋸成 一 1cm 長的小段或完整的樹葉樣品切割成 大小的小方片 ， 按上述表面消毒處理后 ， 置于分離平板上 ， 25℃ 黑暗培養(yǎng) 。 對照平板為未經(jīng)表面消毒處理的樣品直接置于 平板上以及經(jīng)表面處理的樣品置于平板上 5min 后取出 。 至少培養(yǎng) 7 天后樣品表面或邊緣出現(xiàn)菌絲生長 ， 挑取 與對照平板上不同的所有種類的 菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng) ， 待純化后 分別 制成斜面 4℃ 保存 。 根據(jù)在 PDA 培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生孢子 進(jìn)行初步分類 。 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)及抗菌試驗 挑取經(jīng)活化的內(nèi)生真菌菌絲或 孢 子接種于 PD 液體培養(yǎng)基中 ， 25℃ 、 120r/min 黑暗培養(yǎng) ， 至有大量菌絲顆粒出現(xiàn)后作為種子液以 10%接種量接入新鮮 PDA 液體中 ， 靜置培養(yǎng) 。 5000r/mln 離心 15min 去除菌絲體 ， 收集上清液 ， 冷凍干燥 。 用適量無菌水洗下冷凍干燥的殘留物 ， 制成加倍的濃縮液 ， 4℃ 保存待用 。 采用改良的平板孔阱擴(kuò)散法研究發(fā)酵濃縮液的抗菌活性 。 將活化好的 7 種抗菌試 驗指示菌種用冷卻的肉湯培養(yǎng)基 (細(xì)菌 )或 PDA 培養(yǎng)基 (真菌 )稀釋至 106 cfu/ml(細(xì) 菌 )或 106 /ml 個 細(xì)胞或 孢 子 (真菌 )以上 ， 倒平板 。 待培養(yǎng)基冷凝后 ， 用直徑為 7mm 的打孔器于平板上均勻打出三個孔 ， 吸取 10uL 融化的培養(yǎng)基封底以防止培養(yǎng)基與平皿底的出現(xiàn)裂隙 。 分別吸取處理好的真菌發(fā)酵液 100uL 注入孔中 ， 37℃ (細(xì)菌 )或 25℃ (真菌 )下分別培養(yǎng) 24h、 96h 后測量抑菌圈大小 ， 計算平均值 。 . 內(nèi)生真菌 XY— 28 菌株 DNA 的提取 采用改良的氯化芐 法 [17] (l)取 左右凍干菌絲加液氮研磨 ， 轉(zhuǎn)移至 7ml 滅菌離心管中 ， 依次加入抽 提液 2mL、 10%、 氯化 芐 ， 振蕩使成乳狀 ， 50℃ 水浴 l~2h， 其間每隔 l0min銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 10 振蕩混勻一次 。 (2)加入 3MNaAc， 冰水浴 15min， 6000rpm 離心 l5min。 (3)吸取上清液 ， 加入等體積氯仿 ： 異戊醇 (24： l)輕輕顛倒混勻 。 9000rpm 離心 10min。 (4)吸取上清 液至干凈離心管 ， 加入 ~1 倍體積異丙醇 ， 輕輕顛倒混勻 ， 冰 箱冷凍層放置 40min~2h， 可見白色絮狀沉淀 。 (5)10000rpm 離心 10min， 棄上清 ， 用 70%乙醇洗滌沉淀 。 加入 無菌重 蒸水溶解沉淀 。 結(jié)果和分析 銀杏內(nèi)生真菌的分離方法比較 共分離純化得到菌株 55 株 ， 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定 ， 結(jié)果見表 21。 通過在培養(yǎng)基中加入孟加拉紅抑制細(xì)菌和部分酵母的生長 ， 同時采用 4 種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行分離 ， 獲得了 29 株菌種 ， 其中 %在 PDA 培養(yǎng)基上為產(chǎn) 孢 真菌 ， 且交鏈 孢 霉屬 、曲霉屬 和青霉屬等環(huán)境常見菌較普遍 ， 不產(chǎn)孢 真菌只有 %。 由于孟加拉紅銀杏內(nèi)生菌的分離與抗菌活性菌株的分類鑒定的使用也會影響某些真菌的生長 ， 故實(shí)驗又采用了水瓊脂平板 ， 目的是建立與宿主植物內(nèi)環(huán)境類似的生態(tài)模型 ， 從 而 較為真實(shí)地反映植物內(nèi)生菌的生物學(xué)特征 ， 所分離的菌株中 %在 PDA 培養(yǎng)基上為不產(chǎn) 孢 真菌 ， 實(shí)驗組平板上出現(xiàn)的菌落明顯不同于對照組 ， 且表面消毒的樣品與平板接觸后無菌生長 ， 說明表面消毒徹底 ， 無表面菌的污染和干擾 （ 21 所示 )。 已有的研究表明 ， 植物內(nèi)生真菌長期與宿主共存 ， 在人工培養(yǎng)條件下通常為無 孢 菌群 [l8]， 因此本研究中水瓊脂法與孟加拉紅法相比更適合于內(nèi)生真菌的分離 (22 所示 )。 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 11 圖 2— 1 對照組水瓊脂平板分離內(nèi)生其菌 — 1Water agar plates as controls (A)樣品未消毒 。(B)樣品消毒后接觸 圖 2 一 2 水瓊脂平板分離內(nèi)生真菌 — 2Water agar plate with endophytic fungi 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 12 表 2 一 1 55 株銀杏內(nèi)生真菌類群表 Table 22 Taxa of 55 endophytic fungi strains Ginkgo biloba 分離方法 菌株編號 分類群 株數(shù) 占總數(shù)的 % Methods Strains No. Taxa Numbers Percentage 孟加拉 2 紅 M 1～ 29 交鏈孢霉屬 1 曲霉屬 青霉屬 毛霉屬 鏈孢霉屬 不產(chǎn)孢真菌 酵母 6 10 1 1 9 1 水瓊脂法 YX 1～ 26 小單頭孢霉屬 1 交鏈孢霉屬 簡梗孢霉屬 不產(chǎn)孢真菌 3 3 19 抗菌活性菌株的篩選 對 55 株內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行抗菌試驗 ， 共篩選得到 23 株至少對一種指示菌的生長有抑制作用的菌株 ， 結(jié)果見表 2— 2。 選用的 7 株指示菌中 ， 金黃色葡萄球菌的敏感性最強(qiáng) ， 共有 20 株內(nèi)生菌發(fā)酵物對其生長有抑制作用 ， 而 其它指示菌相對不及金黃色葡萄球菌敏感 ， 活性菌株分別有 5 株對大腸桿菌 、 2 株對枯草芽 孢 桿菌 、 4 株對白酵母 、 5株對紅酵母 、 3 株對青霉 、 4 株對黑曲霉有抑制作用 。 具有抗菌活性的菌株占總分離菌株的 %， 其 中 3 株為交鏈 孢 霉 ， 5 株為青霉 ， 2 株為曲霉 ， 1 株為簡梗 孢 霉 ， 1 株為小單頭 孢 霉 ， 其它 11 株為不產(chǎn) 孢 真菌 ， 占活性菌株的 %。 23 株活性菌株中有 20 株由樹枝中分離所得 ， 占活性菌株的 %。 以孟加拉紅分離所得的 29 株菌中 ， 有 12 株具有抗菌活性 ， 占該分離方法總菌株數(shù)的 %， 其中不產(chǎn) 孢 真菌 4 株 ， 分別占總菌株數(shù)和活性菌株的 %、 %。 相比之下 ， 以水瓊脂法分離所得的 26 株菌中有 11 株具有抗菌活性 ， 占該分離方法總菌株銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 13 數(shù)的 %， 其中不產(chǎn) 孢 真菌 7 株 ， 分別占總菌株數(shù)和活性菌株的 %、 %，可見采用水瓊脂法分離所得的抗菌活性菌株比例明顯高于孟加拉紅法 ， 進(jìn)一步說明了水瓊脂法用于內(nèi)生真菌分離的優(yōu)越性 ， 采用該方法分離所得的活性菌株值得進(jìn)一步研究 ，分別采用形態(tài)學(xué)特征和 ITS 序列分析對 4 株產(chǎn) 孢 菌和 7 株不產(chǎn) 孢 菌進(jìn)行分類 。 根據(jù)分生孢 子形態(tài)對其中 4 株產(chǎn) 孢 菌進(jìn)行鑒定 ， YX 一 2 為簡梗飽霉屬 (Chromosporium sp.)、 YX一 9 為小單頭 孢 霉屬 (Acremoniella sp.)、 YX 一 30 和 YX 一 45 均為交鏈 孢 霉 (Alternaria spp.)。 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測定 14 表 2 一 2 銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性 Table 23 Antimicrobial activity of cultures of endophytic fungi 菌株編號 分類群 分離部位 大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 釀酒酵母 紅酵母 青霉 曲霉 M1 交鏈孢霉 樹枝 N 19 N N N N N M6 青霉 樹枝 N 17 N N N N N M7 青霉 樹枝 N 17 N N N N N M8 青霉 樹枝 N 17 N N N N N M11 青霉 樹枝 N N N N 15 N N M13 青霉 樹枝 N 27 N N N N N M14 曲霉 樹枝 N 17 N 15 13 N 13 M17 曲霉 樹枝 N 17 N 17 11 20 N M20 不產(chǎn)孢真菌 樹枝 N N N N N N 18 M23 不產(chǎn)孢真菌 樹枝 24 N N N 15 N N M25 不產(chǎn)孢真菌 樹枝 N 16 N N N N N M27 不產(chǎn)孢真菌 樹枝 N 21 N N N N N YX2 簡梗孢霉 樹枝 N 16 N N N N YX9 小