【正文】 /L EDTA()加水定容至 100ml。 500mmol/L EDTA（ ) ： 在 80ml 水中加入 乙二胺四乙酸二鈉 ( Na2 EDTA 12l℃ 、 15min 滅菌 ； 細(xì)菌培養(yǎng)基 ： 肉湯培養(yǎng)基 (牛肉膏 3g， 蛋白陳 10g， 氯化鈉 5g， 瓊脂 12g， 水 1000ml， 一 )； . 主要儀器設(shè)備 全溫?fù)u瓶柜 — 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠 生化培養(yǎng)箱 — 上海益恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 潔 凈工作臺(tái) — 蘇凈集團(tuán)安泰公司 數(shù)顯恒溫水浴鍋 — 國(guó)華電器有限公司 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測(cè)定 8 電泳儀 — 北京六一儀器廠 分光光度計(jì) — HITACHI 離心機(jī) — 上海安亭科學(xué)儀器廠 PCR 儀 — 真空冷凍干燥儀 — 德國(guó) CHRIST 公司 電熱手提式壓力蒸汽消毒器 — 上海醫(yī)用核子儀器廠 生物顯微鏡 — 尼康 H60OL 掃描式電子顯微鏡 ， HnACHI . 主要試劑 （ 1） 10%SDS()： 90ml 水中加入 10g 電泳級(jí)十二烷基磺酸鈉 (SDS)， 加熱至 68℃助溶 ， 用 Na0H 調(diào) ， 加水定容至 100ml。 培養(yǎng)基 [18] 銀杏內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基 ： 水瓊脂培養(yǎng)基 (瓊脂 20g， 水 l000ml)； 孟加拉紅培養(yǎng)基(分別在 PDA、 CMA、 SDA、 YEA 培養(yǎng)基中加入孟加拉紅使其終濃度達(dá) 40PPm)； PDA： 馬鈴薯 200 g， 葡萄糖 20 g， 瓊脂 20g， 水 1000ml， 自然 pH， 121℃ 、 20min滅菌 ； 液體 PD 不含瓊脂 ； CMA： 玉米粉 40g， 蔗糖 10g， 瓊脂 20g， 水 l000ml， 自然 pH， 121， C、 20min滅菌 ； SDA： 蛋白陳 10g， 麥芽糖或葡萄糖 40g， 瓊脂 15g， 水 1000ml， 調(diào) 節(jié) ， 121℃ 、20min 滅菌 ； YEA： 酵母膏 5g， 葡萄糖 20g， 硫酸錢(qián) ， 磷酸二氫錢(qián) ， 瓊脂 12g， 水1000ml， 調(diào) 節(jié) ， 121℃ 、 20min 滅菌 ； 查氏培養(yǎng)基 ： 蔗 20g， 硝酸鈉 3g， 氯化鉀 ， 硫酸亞鐵 ， 磷酸氫二鉀 1g，硫酸鎂 ， 水 1000ml， 瓊脂 15g。 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測(cè)定 7 抗菌實(shí)驗(yàn)指示菌 大腸桿菌 (Escherichia coli AS )、 金黃色葡萄球菌 (Staphylocous aureus AS )、枯草芽 孢 桿菌 (Bacillus subtilis)、 釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、 紅酵母 (Rhodotorula sp.)、 青霉 (Penicillium sp.)、 黑曲霉 (Aspergillus niger)。 實(shí)驗(yàn) 材料 ． 銀杏樣品來(lái)源和采集方法 采集 湖北省襄陽(yáng)市湖北文理學(xué)院內(nèi) 銀杏樹(shù)上直徑為 2 一 3cm 左右的健康樹(shù)枝及新鮮樹(shù)葉 ， 經(jīng) 70%酒精表面擦洗消毒后在火焰上灼燒 10s 左右使酒精揮發(fā) ， 標(biāo)號(hào) ， 存放于滅菌小袋中 。 但目前對(duì)內(nèi)生真菌抗氧化和抗菌的研究還很少 。 對(duì)這一領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)研究在很大程度上避免了傳統(tǒng)的開(kāi)發(fā)土壤微生物所遇到的重復(fù)篩選的缺點(diǎn) 。 同時(shí) ， 植物資源本身比較稀少 ， 生長(zhǎng)速度相對(duì) 緩慢 ， 再生較難 ， 容易造成生態(tài)破壞等問(wèn)題 ， 制約了植物源產(chǎn)品的開(kāi)發(fā) 。 銀杏內(nèi)生真菌分離鑒定及其抗菌抗氧化作用研究相對(duì)于化學(xué)添加劑來(lái)說(shuō) ， 植物 、 微生物等產(chǎn)生的天然生物活性物質(zhì)具有安全 、 高效 、 低毒 、 不在人畜體內(nèi)積累等特點(diǎn) ， 為新型添加劑的應(yīng)用開(kāi)拓了美好的前景 。 為了解決這一問(wèn)題 ， 合成的抗 氧化劑在工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用 。 微生物領(lǐng)域就是一個(gè)極具吸引力的天然活性物質(zhì)來(lái)源 。食品的微生物腐敗是一個(gè)全世界廣泛關(guān)注的問(wèn)題 ， 為了延長(zhǎng)食品原料及產(chǎn)品的貨架期 ，銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測(cè)定 6 必須嚴(yán)格控制其中微生物的生長(zhǎng) 。 申屠旭萍和俞曉平從銀杏的根 、 莖 、 葉中分離到 /株內(nèi)生真菌 ， 發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌數(shù)量與銀杏樹(shù)齡有關(guān) ， 樹(shù)齡越高 ， 其含有的內(nèi)生真菌數(shù)量越多 ， 抗菌試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明其中 29 株銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)作物病原真 菌具有一定的抑制作用 。 蔣繼宏等分離出一株產(chǎn)香銀杏內(nèi)生真菌徹 arium sp， 采用 Gc 艦 s 對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行分析 ， 分離出 24 種組分 ， 鑒定出 15 種成分 ， 并發(fā)現(xiàn)該揮發(fā)油具有抗菌活性 。 銀杏含有豐富的營(yíng)養(yǎng)保健因子 (如銀杏內(nèi)酷和銀杏黃酮 )， 同時(shí)具有很強(qiáng)的抗病毒 、 抗菌消炎 、 抗過(guò)敏等作用 ， 許多植物生態(tài)學(xué)家和生理學(xué)家對(duì)銀杏進(jìn)行考察研究 ， 認(rèn)為其在逆境中幾乎不感染任何病蟲(chóng)害 、 壽命極長(zhǎng)的奧秘關(guān)鍵在于銀杏體內(nèi) 、 葉中細(xì)胞組織中含有一種自衛(wèi)免疫抗菌的特殊化學(xué)物質(zhì) ， 即殺菌素 ， 如 a 一乙烯醛和多種有機(jī)酸等 。 銀杏曾廣泛分布于北半球 ， 到了新生代的第三紀(jì)末和第四紀(jì)初 ， 北半球進(jìn)入冰川期 ， 世界上大部分地區(qū)的銀杏完全絕種 ， 惟獨(dú)我國(guó)少數(shù)地區(qū)的銀杏幸免于難 ， 成為現(xiàn)存種子植物中最古老的 。 植物中銀杏內(nèi)生真菌的研究概況 銀杏 (Ginkgo biloba L.)是我國(guó)特有的多用途樹(shù)種 ， 起源于 2 億 3 千萬(wàn)年前的石 炭紀(jì) ， 是最古老的中生代孑遺植物之一 ， 基本保持了 億年前的生態(tài)特征 。植物來(lái)源的活性物質(zhì)含量一般很低 ， 而 且目前世界上的植物資源也日益減少 ， 因此從植銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測(cè)定 5 物中分離這些物質(zhì)的成本很高 ， 如紫杉醇每克高達(dá) 6000 美元 [14]。 另外 ， 內(nèi)生真菌可增強(qiáng) 宿主抗干旱的能力 。 Lyons 等發(fā)現(xiàn)在低水平氮源的土壤中 ， 內(nèi)生真菌可增加宿主對(duì)氮元素的吸收 ， 在侵染內(nèi)生真菌的高羊茅的葉子中 ， 氮元素的含量明顯高于沒(méi)有感染內(nèi)生真菌的高羊茅 [9] 。 （ 1） 增強(qiáng)宿主的生長(zhǎng) 許多內(nèi)生菌可產(chǎn)生 IAA、 叫噪乙睛以及細(xì)胞激動(dòng)素等植物生長(zhǎng)激素促進(jìn)宿主生長(zhǎng) ，Lu 等從黃花篙中分離到的一株內(nèi)生真菌在發(fā)酵液中也能積累 IAA[8]， 因此感染內(nèi)生真菌的植物一般比未感染內(nèi)生 真菌的植物生長(zhǎng)快 。 在內(nèi)生菌一植物宿主一食草動(dòng)物生態(tài)系統(tǒng)中 ， 植物內(nèi)生菌扮演著前所未知的重要生態(tài)學(xué)作用 。 而 且 ， 內(nèi)生真菌分布于植物組織內(nèi) ， 可獲得足夠的碳源 、 氮源 ， 受到植物組織的良好保護(hù) ， 因 而 比暴露于惡劣環(huán)境的附生菌和腐生菌具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境 ， 更易于發(fā)揮作用 。同一植物的不同組織其內(nèi)生菌的種類(lèi)不相同 ， 不同季 節(jié) 同一植物內(nèi)生菌的種類(lèi)和數(shù)量也不相同 [7]。內(nèi)生菌系統(tǒng)地分布于植物體的各部分組織、器官及細(xì)胞間隙中 ， 其中葉、葉鞘和種子內(nèi)的菌絲含量最多 [6]。常見(jiàn)的屬有 ： 曲霉屬 CAspergillus)、毛霉屬 (Mwcott)、刺盤(pán)孢屬 (Colletotrichum)、擬蓮點(diǎn)霉屬 Phomopsis)、葉點(diǎn)霉屬 (^、嫌 孢 霉屬 CFusarium)等 [5]。從目前已經(jīng)研究過(guò)的植物來(lái)看 ， 還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)未分離到內(nèi)生真菌的物種 ， 因此可以推斷內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)是普遍存在的 [4] 。 內(nèi)生真菌多樣性 地球上有上百萬(wàn)種植物 ， 幾乎所有的植物中都有內(nèi)生菌。內(nèi) 生菌包括內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌 ， 其中內(nèi)生真菌的分離頻率最高 ， 自 1898 年 vogl 從黑麥草 Lolium temulentum ， 關(guān)于內(nèi)生真菌的研究已有一百多年的歷史 ， 但由于內(nèi)生菌生活在沒(méi)有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)部 ， 其存在和作用長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所忽視 。 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測(cè)定 3 內(nèi)生真菌 植物內(nèi)生真菌簡(jiǎn)介 植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌 ， 被感染的宿主植物 (至少是暫時(shí) )不表現(xiàn)出外在病癥 ， 可通過(guò)組織學(xué)方法從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA 的方法來(lái)證明其內(nèi)生 [1] 。 銀杏是我國(guó)的一種珍稀植物 ， 是現(xiàn)存種子植物中最古老的 “ 活化石 ” ，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)保健因子 (如銀杏內(nèi)醋和銀杏黃酮 )， 同時(shí)具有很強(qiáng)的抗病毒 、 抗菌消炎 、抗過(guò)敏等作用 ， 在生長(zhǎng)過(guò)程中幾乎不感染病蟲(chóng)害 、 壽命極長(zhǎng) ， 因此從銀杏中分離到具有抗菌活性的內(nèi)生真菌的可能性非常大 。 與植物表面菌或土壤微生物相比 ， 內(nèi)生菌與相應(yīng)宿主有著更近的生物聯(lián)系 ， 因此可被利用生產(chǎn)大量的生物活性物質(zhì) 。 目前世界上許多人都在對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分離并研究其產(chǎn)物 。 Significant activity of three bacteria antimicrobial properties and stable does not produce robe, studied the morphological and molecular analysis, optimize the culture conditions and medium position, antibacterial activity of the fermentation substances into miseparation and structural identification, for further industrialized production application work provide dhi and basis. Ginkgo, also known as ginkgo, is our country unique rare and precious tree species, and the movement of glacier is the legacy of precious plants, known as living fossils, the research and development has a very high value. each group of ginkgo contains antibacterial substances, according to reports, root, stem and leaf, ginkgo pulp (testa) and the nut extracts of rice sheath blight fungus, a cucumber anthrax and solanacearum, have obvious effect on inhibition of growth . This study material for ginkgo, separating filter has the bacteriostasis of endophytic fungi, purport for the development and the development of new microbial pesticides provide excellent strains. Key words： Endophytic fungi； Ginkgo； antimicrobial properties；separation 銀杏內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)與生物活性測(cè)定 1 目錄 ......................................................................................................................................................... 1 1．前言 ................................................................................................................................................... 2 內(nèi)生真菌 .......................................................................................................................................... 3 植物內(nèi)生真菌簡(jiǎn)介 .............................................................................................................. 3 內(nèi)生真菌多樣性 .................................................................................................................. 3 內(nèi)生真菌的生物學(xué)作用 ...................................................................................................... 4 植物中銀杏內(nèi)生真菌的研究概況 .......................