【文章內(nèi)容簡介】 鈉鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？用無水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。5．在用乙醇沉淀DNA時，～？在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝）和硼酸系統(tǒng)（pKa=）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用TrisHCl（pKa=）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用TrisHCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA？采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20％。，％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯仿較好？酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。10．為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？因?yàn)榉优c水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，％。8羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris ，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)?，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。去年做了半年載體構(gòu)建，連接無疑是其中重要的一關(guān)，根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)心得和已有資料做個總結(jié)，希望對大家有用，同時希望戰(zhàn)友們批評指正！互相進(jìn)步！首先說說2片段連接通常是指目的片斷和載體片斷的連接，包括①小片段（目的片斷小于載體片斷的大?。┖洼d體片段的連接，這種情況多些，也比較容易連接，按照說明書要求的比例進(jìn)行即可，比如TAKARA的pMD19T Simple Vector連接時Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為1 ：2～10即可，如果效果不佳，檢測一下感受態(tài)細(xì)胞，如果片斷過小比如幾十bp，連接時要加大小片段的摩爾數(shù)，多連幾管，挑選白斑，以上是指雙酶切后的連接，即載體和目的片斷倆端的酶切位點(diǎn)相同；②大片段（目的片斷與載體片斷的大小差不多甚至大于載體的大小）和載體片段的連接，目的片斷與載體片斷的大小差不多的情況應(yīng)盡量避免，因?yàn)檫@會給目的片斷膠回收帶來麻煩，我就遇到過這種情況，膠回收時很是費(fèi)盡，最后勉強(qiáng)分開，當(dāng)然換個載體也許就解決問題了。我做過3000多bp和pMD19T Simple Vector的連接，開始不行，后來成功了，連接率不高，我的經(jīng)驗(yàn)是如果感受態(tài)細(xì)胞沒問題，那就反復(fù)試目的片斷和載體片斷的連接比例，可以超出此范圍1 ：2～10一試。再說說多片斷的連接做多個片斷的連接，首先強(qiáng)調(diào)一個問題，那就是大家一定要注意所有片斷倆端的酶，把他們的特征要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同時連接時這個問題就太重要了；多片段連接要總體先規(guī)劃好了，再開始入手設(shè)計(jì)引物，否則考慮不周后患無窮啊,呵呵?、俣嗥瑪?