rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(編輯修改稿)
2025-06-09 22:36 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。3）水/緩沖液一定要確保無 Rnase 污染。4）實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。5）內(nèi)源 Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。6）RNA 樣品RNA 抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的 Rnase 污染。7）質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導(dǎo)致 RNA 降解。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。9）陽離子 （Ca， Mg）在含這些離子時，80C 加熱 5 分鐘會導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑 （1mM Sodium Citrate， pH ）。10）后續(xù)實驗所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。RNA 抽提的10大竅門1：快速阻止 Rnase 活性樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活 Rnase。2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。3：預(yù)判質(zhì)量要求Northern，cDNA 文庫構(gòu)建對完整性要求高，RTPCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 對完整性要求不是很高。RTPCR 對純度 （酶抑制物殘留） 要求很高。4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。5：檢查 RNA 的完整性電泳檢測，28S：18S =2：1 是完整的標(biāo)志，1：1 對大部分實驗也是可以接受的。6：去除 DNA用于 RTPCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。9：徹底溶解 RNA，必要時可以 65C 加熱 5 分鐘。10：合適的保存方法 – 短時間可以 –20C 保存，長期請保存于 –80C。提高 RNA 得率首先要意識到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。高豐度 （24ug/mg） 的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度 （） 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度 （） 的如膀胱，骨，脂肪。1：裂解細(xì)胞使 RNA 釋放出來 – RNA 如果不被釋放出來，得率是會降低的。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化 （Lysozyme/Lyticase）2：抽提方法的優(yōu)化?；诒椒拥姆椒ǖ淖畲髥栴}是分層不徹底和部分 RNA 的丟失（不能全部將上清取出）。分層不徹底是因為核酸和蛋白質(zhì)含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機層后再離心的方法降低?；谥x心式方法的最
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