rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)(存儲(chǔ)版)
【正文】 9）陽(yáng)離子 （Ca， Mg）在含這些離子時(shí)，80C 加熱 5 分鐘會(huì)導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑 （1mM Sodium Citrate， pH ）。6：去除 DNA用于 RTPCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。1：裂解細(xì)胞使 RNA 釋放出來(lái) – RNA 如果不被釋放出來(lái)，得率是會(huì)降低的。高速離心 2 分鐘。室溫靜置 510分鐘后，溶解。但如果裂解液太粘稠 （因?yàn)楹怂岷扛叩木壒剩?，PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問(wèn)題。這些特點(diǎn)決定了它們是非常強(qiáng)的酶抑制劑。1RNA 質(zhì)量的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度?，F(xiàn)在大家卻在拿 A260/A280 當(dāng)‘因’用，認(rèn)為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會(huì)產(chǎn)生困惑。RNAguard：抑制組織/細(xì)胞內(nèi)源酶的試劑綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。使用 RNAguard 的操作非常簡(jiǎn)單：在取組織前預(yù)先估計(jì)組織的重量，在一個(gè)容器中加入 510 倍體積的 RNAguard，放在手邊。RNAguard適用的樣品包括：動(dòng)物組織，培養(yǎng)細(xì)胞，昆蟲(chóng)，及部分植物組織。要考慮設(shè)備的線形范圍 （A260 要處于 – 之間）。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 左右。實(shí)驗(yàn)表明，冷凍組織在融化過(guò)程中比新鮮組織更容易發(fā)生 RNA 的降解。如果降解問(wèn)題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。3）核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。2）7080% 乙醇洗滌：洗滌時(shí)，一定要將核酸懸浮起來(lái)，才能保證殘留的鹽被洗去?；谥x心式方法的最大問(wèn)題是樣品過(guò)量。提高 RNA 得率首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會(huì)導(dǎo)致 RNA 降解。2）槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過(guò)的。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織?？傊绻霈F(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問(wèn)題也就可以徹底解決了。經(jīng)檢測(cè)不含 RNase、DNase和proteinase。關(guān)于降解問(wèn)題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。cDNA
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