rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)-文庫吧
2025-04-28 22:36 本頁面
【正文】 素樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。細(xì)胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長。RNA 抽提的“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNaseFree。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意五：選擇合適的裂解液。注意六：控制好樣品的起始量。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。RNase 污染的10大來源1）手指頭，手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。2）槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過的。移液器最好是專用的，用前用 75% 的
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