rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(完整版)
【正文】 液，尤其是水，必須確保 RNaseFree。裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結(jié)合純化方法一起考慮。這兩個辦法都要求操作快速。影響后續(xù)實驗的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。RNA 抽提的“三大紀(jì)律八項注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。5）內(nèi)源 Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。RNA 抽提的10大竅門1：快速阻止 Rnase 活性樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活 Rnase。8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑?；诒椒拥姆椒ǖ淖畲髥栴}是分層不徹底和部分 RNA 的丟失（不能全部將上清取出）。決不能取到中間層。這些組織細胞密度低，故單位重量的組織 RNA 的含量就少，最好用盡可能多的起始量。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。1樣品凍融的影響冷凍的樣品可能較大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎都得不到 2：1 的比例 （此結(jié)論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得）?，F(xiàn)實是，許多抽提 RNA 時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對 A260/A280 產(chǎn)生影響。碾磨過程中要及時補充液氮以防止組織融化。抽提前先用鑷子將組織從 RNAguard 中取出，在室溫進行切割和稱重后，移入裂解液中快速勻漿。這么嚴(yán)格的操作，是沒有多少實驗人員去認真執(zhí)行的。純 RNA 的曲線具有如下特點：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個拐點，A300 接近 0，A260/A280 = 左右，A260/A230 = 左右。使用非變性電泳檢測 RNA，以 DNA Marker 做對照，如果 2kb 處的 28S 和 處的 18S 條帶清晰，且 28S：18S 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗
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