rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)-wenkub.com
2025-05-10 22:36 本頁(yè)面
【正文】 取出所需組織后，立即切割成厚度小于 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。RNAguard 能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動(dòng)物組織/細(xì)胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一個(gè)月不降解，20C 一年以上不降解。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。如果沒(méi)有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測(cè)定 A260/A230 比值，因?yàn)樵摫戎祵?duì)所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。有興趣的話，可以在您的 RNA 樣品中加入一點(diǎn)抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG 等，再測(cè) A260/A280 比值。A260/A280 是一個(gè)給大家?guī)?lái)許多困惑的指標(biāo)。理論上，完整的 RNA 擁有 28S：18S = ：1 的比例，大部分資料則強(qiáng)調(diào) 28S：18S = 2：1 的比例。有時(shí)候，液氮碾磨過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)樣品的融化；或者冷凍樣品不經(jīng)過(guò)液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會(huì)出現(xiàn)融化。目前，商品化的 RNA 抽提試劑經(jīng)過(guò)小量調(diào)整，可以適合幾乎所有的動(dòng)物組織，但卻沒(méi)有一種商品化的 RNA 抽提試劑，可以適合大部分植物組織。一般，大家都是在液氮條件下對(duì)植物進(jìn)行碾磨的，所以?xún)?nèi)源酶作用使 RNA 降解的現(xiàn)象不常見(jiàn)。多次PCI抽提可以去除更多殘留的 DNA。必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。1特殊組織的抽提1）纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提 RNA 關(guān)鍵在徹底破碎組織?；煸蕰r(shí)不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。小心取上清 （8090%）。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機(jī)層后再離心的方法降低。電動(dòng)勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結(jié)合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化 （Lysozyme/Lyticase）2：抽提方法的優(yōu)化。10：合適的保存方法 – 短時(shí)間可以 –20C 保存，長(zhǎng)期請(qǐng)保存于 –80C。7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。RTPCR 對(duì)純度 （酶抑制物殘留） 要求很高。10）后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。7）質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。4）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNaseFree。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿(mǎn)意的結(jié)果，但操作時(shí)間長(zhǎng)。裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。細(xì)胞無(wú)須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能
醫(yī)療健康相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1