rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項-免費閱讀
【正文】 經(jīng)過 RNAguard 處理的樣品可以用幾乎所有常用的 RNA 方法/試劑抽提 RNA，所有的操作與用新鮮組織沒有什么不同。另外有兩個有用的現(xiàn)象：在水中測定 A260/A280，比值將變低 左右；而在 10mM EDTA 中測定的比值比在 1mM EDTA 中測定的高 左右。純 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’?？赡艿脑蚴牵簝鋈谶^程破壞了細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)源酶更容易與 RNA 直接接觸。許多植物的內(nèi)含雜質(zhì)都會導(dǎo)致殘留，之所以殘留，往往是因為這些雜質(zhì)與 RNA 有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。同時，在倒掉乙醇后，立即高速離心數(shù)秒，再用移液器去除殘留的乙醇。經(jīng)典抽提小技巧1）Phenol 純化：將等體積的 1：1 Phenol/Chloroform 加入，劇烈混允 12 分鐘。高豐度 （24ug/mg） 的如肝臟，胰腺，心臟，中豐度 （） 的如腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢，低豐度 （） 的如膀胱，骨，脂肪。5：檢查 RNA 的完整性電泳檢測，28S：18S =2：1 是完整的標(biāo)志，1：1 對大部分實驗也是可以接受的。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。移液器最好是專用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。注意五：選擇合適的裂解液。純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對于干凈的樣品，如細胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) – 用嘴碾磨，腸胃抽提。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。%的DEPC內(nèi)，%的DEP,避光、靜置、過夜（1224 h）裝槍頭和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，將槍頭或者EP管內(nèi)的DEPC水大致去除干后，裝起，包好121攝氏度，30min180攝氏度，干燥數(shù)個鐘頭（至少3小時以上）。注意：a、處理DEPC時需要戴乳膠手套、口罩！ b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高壓滅菌（許多實驗室高溫滅菌兩次）二、RNA提取注意事項組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求不盡相同。樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。注意六：控制好樣品的起始量。3）水/緩沖液一定要確保無 Rnase 污染。
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