【正文】 一般，大家都是在液氮條件下對植物進行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使 RNA 降解的現(xiàn)象不常見。A260/A280 是一個給大家?guī)碓S多困惑的指標。RNAguard 能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動物組織/細胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一個月不降解，20C 一年以上不降解。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。理論上，完整的 RNA 擁有 28S：18S = ：1 的比例，大部分資料則強調(diào) 28S：18S = 2：1 的比例。多次PCI抽提可以去除更多殘留的 DNA。小心取上清 （8090%）。7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導入酶。4）實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應的雜質(zhì)，但價格較貴；使用經(jīng)濟而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時間長。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RTPCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細胞中抽提 RNA 不容易降解。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。后者適合所有的樣品，而前者只適合細胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。紀律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導致 RNA 降解。提高 RNA 得率首先要意識到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。2）7080% 乙醇洗滌：洗滌時，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導致。首先要明確該指標用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 左右。RNAguard適用的樣品包括：動物組織，培養(yǎng)細胞，昆蟲，及部分植物組織。RNAguard：抑制組織/細胞內(nèi)源酶的試劑綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。1RNA 質(zhì)量的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。但如果裂解液太粘稠 （因為核酸含量高的緣故），PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。高速離心 2 分鐘。6：去除 DNA用于 RTPCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。3）水/緩沖液一定要確保無 Rnase 污染。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求不盡相同。注意：a、