【正文】 一般，大家都是在液氮條件下對(duì)植物進(jìn)行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使 RNA 降解的現(xiàn)象不常見。A260/A280 是一個(gè)給大家?guī)碓S多困惑的指標(biāo)。RNAguard 能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動(dòng)物組織/細(xì)胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一個(gè)月不降解，20C 一年以上不降解。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。理論上，完整的 RNA 擁有 28S：18S = ：1 的比例，大部分資料則強(qiáng)調(diào) 28S：18S = 2：1 的比例。多次PCI抽提可以去除更多殘留的 DNA。小心取上清 （8090%）。7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導(dǎo)入酶。4）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長(zhǎng)。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對(duì) RNA 完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RTPCR 對(duì) RNA 完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問題也就可以徹底解決了。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會(huì)導(dǎo)致 RNA 降解。提高 RNA 得率首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。2）7080% 乙醇洗滌：洗滌時(shí)，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 左右。RNAguard適用的樣品包括：動(dòng)物組織，培養(yǎng)細(xì)胞，昆蟲，及部分植物組織。RNAguard：抑制組織/細(xì)胞內(nèi)源酶的試劑綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。1RNA 質(zhì)量的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。但如果裂解液太粘稠 （因?yàn)楹怂岷扛叩木壒剩琍CI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。高速離心 2 分鐘。6：去除 DNA用于 RTPCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。3）水/緩沖液一定要確保無 Rnase 污染。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。注意：a、