rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項-文庫吧資料
2025-05-19 22:36本頁面
【正文】 織要增加一步氯仿抽提?；诒椒拥姆椒ǖ淖畲髥栴}是分層不徹底和部分 RNA 的丟失（不能全部將上清取出）。1：裂解細(xì)胞使 RNA 釋放出來 – RNA 如果不被釋放出來，得率是會降低的。提高 RNA 得率首先要意識到不同得樣品其 RNA 含量差別很大。9：徹底溶解 RNA，必要時可以 65C 加熱 5 分鐘。8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。6：去除 DNA用于 RTPCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。3：預(yù)判質(zhì)量要求Northern，cDNA 文庫構(gòu)建對完整性要求高，RTPCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 對完整性要求不是很高。RNA 抽提的10大竅門1：快速阻止 Rnase 活性樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活 Rnase。9）陽離子 （Ca， Mg）在含這些離子時，80C 加熱 5 分鐘會導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑 （1mM Sodium Citrate， pH ）。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導(dǎo)致 RNA 降解。6）RNA 樣品RNA 抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的 Rnase 污染。5）內(nèi)源 Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。3）水/緩沖液一定要確保無 Rnase 污染。2）槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過的。另外，口罩也必需戴，因為呼吸也是一個重要的酶來源。注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。注意六：控制好樣品的起始量。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。RNA 抽提的“三大紀(jì)律八項注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。只有一個例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。使用液氮碾磨要特別注意一點：在整個碾磨過程中，樣品不得融化，因為冷凍后內(nèi)源酶更容易起作用。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。傳統(tǒng)上，只有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入
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