rna提取準備工作及注意事項-文庫吧在線文庫
【正文】 文庫構建要求 RNA 完整而無酶反應抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RTPCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。細胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細菌需要先用相應的酶破壁后才能勻漿。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應的雜質，但價格較貴；使用經(jīng)濟而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結果，但操作時間長。紀律三：明確自己的抽提目的注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。4）實驗臺面最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。10）后續(xù)實驗所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。7：降低外源酶的污染 – 不能從外面又導入酶。電動勻漿比其它勻漿方法效果更好，但也可能需要結合其它得方法，如液氮搗碎，酶消化 （Lysozyme/Lyticase）2：抽提方法的優(yōu)化。小心取上清 （8090%）。1特殊組織的抽提1）纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提 RNA 關鍵在徹底破碎組織。多次PCI抽提可以去除更多殘留的 DNA。目前，商品化的 RNA 抽提試劑經(jīng)過小量調(diào)整，可以適合幾乎所有的動物組織，但卻沒有一種商品化的 RNA 抽提試劑，可以適合大部分植物組織。理論上，完整的 RNA 擁有 28S：18S = ：1 的比例，大部分資料則強調(diào) 28S：18S = 2：1 的比例。有興趣的話，可以在您的 RNA 樣品中加入一點抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG 等，再測 A260/A280 比值。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。取出所需組織后，立即切割成厚度小于 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。RNAguard 能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動物組織/細胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一個月不降解，20C 一年以上不降解。如果沒有掃描數(shù)據(jù)，也一定要測定 A260/A230 比值，因為該比值對所有影響酶反應的雜質的殘留更敏感。A260/A280 是一個給大家?guī)碓S多困惑的指標。有時候，液氮碾磨過程中也會出現(xiàn)樣品的融化；或者冷凍樣品不經(jīng)過液氮碾磨直接加入裂解液中，在徹底勻漿前肯定會出現(xiàn)融化。一般，大家都是在液氮條件下對植物進行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使 RNA 降解的現(xiàn)象不常見。必須用氯仿再次對上清進行抽提。混允時不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。RNA 的丟失可以用反抽方法或者去除有機層后再離心的方法降低。10：合適的保存方法 – 短時間可以 –20C 保存，長期請保存于 –80C。RTPCR 對純度 （酶抑制物殘留） 要求很高。7）質粒抽提質粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。戴手套口罩的另外的好處是保護實驗人員。注意三：實驗所涉及的試劑/溶
醫(yī)療健康相關推薦
鄂ICP備17016276號-1