rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)-wenkub
2023-05-28 22:36:38 本頁(yè)面
【正文】 勻漿。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。cDNA 文庫(kù)構(gòu)建要求 RNA 完整而無(wú)酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對(duì) RNA 完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RTPCR 對(duì) RNA 完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。也就是說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來(lái)講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的MiliQ純水。經(jīng)檢測(cè)不含 RNase、DNase和proteinase?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問題也就可以徹底解決了。勻漿器方法沒有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個(gè)問題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快?？傊绻霈F(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財(cái)。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。RNA 抽提的“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性注意四：選擇合適的勻漿方法。注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。2）槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過的。5）內(nèi)源 Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。8）RNA 保存即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會(huì)導(dǎo)致 RNA 降解。RNA 抽提的10大竅門1：快速阻止 Rnase 活性樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活 Rnase。4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。提高 RNA 得率首先要意識(shí)到不同得樣品其 RNA 含量差別很大?；诒椒拥姆椒ǖ淖畲髥栴}是分層不徹底和部分 RNA 的丟失（不能全部將上清取出）。基于柱離心式方法的最大問題是樣品過量。決不能取到中間層。2）7080% 乙醇洗滌：洗滌時(shí)，一定要將核酸懸浮起來(lái)，才能
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