rna提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)(更新版)
【正文】 要求了。冷凍的樣品抽提 RNA 前可能還要稱重，這個(gè)過(guò)程肯定會(huì)出現(xiàn)融化。4）植物組織：植物組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜。2）蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮狀物。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。9：徹底溶解 RNA，必要時(shí)可以 65C 加熱 5 分鐘。3：預(yù)判質(zhì)量要求Northern，cDNA 文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RTPCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 對(duì)完整性要求不是很高。6）RNA 樣品RNA 抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的 Rnase 污染。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來(lái)源。注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過(guò)程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來(lái)用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來(lái)用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問(wèn)題幾乎 100% 能獲得解決。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。一、槍頭和EP管等的消毒滅菌%（千分之一）的DEPC（劇毒物），須在通風(fēng)櫥中小心使用，避光，密閉4℃保存。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡(jiǎn)單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來(lái)說(shuō)，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。樣品的收集/保存 – 影響降解的因素樣品離開(kāi)活體/或者原來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開(kāi)始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。RNase 污染的10大來(lái)源1）手指頭，手指頭是外源酶的第一來(lái)源，所以必需戴手套并且頻繁更換。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。分層不徹底是因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低樣品量解決?？梢允褂玫润w積的反應(yīng)液加入 Phenol/Chloroform 中，同樣再取出上清。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。切割過(guò)程中樣品往往出現(xiàn)融化 （可能是部分融化）。RNA 的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)，電泳條件，上樣量，被 EB 飽和的程度等。目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對(duì) RNA 樣品在 200300 nm 范圍掃描。待組織徹底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時(shí)，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿......安全的稱重幾乎不可能。
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