【正文】 待組織徹底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿......安全的稱重幾乎不可能。RNA 的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級結(jié)構(gòu)，電泳條件，上樣量，被 EB 飽和的程度等。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。可以使用等體積的反應(yīng)液加入 Phenol/Chloroform 中，同樣再取出上清。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。注意一：嚴格戴好口罩，手套。樣品的收集/保存 – 影響降解的因素樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。在培養(yǎng)細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。傳統(tǒng)上，只有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。6）RNA 樣品RNA 抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的 Rnase 污染。9：徹底溶解 RNA，必要時可以 65C 加熱 5 分鐘。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。4）植物組織：植物組織比動物組織更為復(fù)雜。使用非變性電泳檢測 RNA，以 DNA Marker 做對照，如果 2kb 處的 28S 和 處的 18S 條帶清晰，且 28S：18S 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗要求了。這么嚴格的操作，是沒有多少實驗人員去認真執(zhí)行的。碾磨過程中要及時補充液氮以防止組織融化。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎都得不到 2：1 的比例 （此結(jié)論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得）。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。決不能取到中間層。8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。5）內(nèi)源 Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。RNA 抽提的“三大紀律八項注意”紀律一：杜絕外源酶的污染。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。現(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。這兩個辦法都要求操作快速。注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNaseFree。7）質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。10：合適的保存方法 – 短時間可以 –20C 保存，長期請保存于 –80C?；煸蕰r不能太溫和，也不要試圖取出全部上清。