rna提取準備工作及注意事項(參考版)
2025-05-16 22:36本頁面
【正文】 抽提前先用鑷子將組織從 RNAguard 中取出，在室溫進行切割和稱重后，移入裂解液中快速勻漿。使用 RNAguard 的操作非常簡單：在取組織前預(yù)先估計組織的重量，在一個容器中加入 510 倍體積的 RNAguard，放在手邊。RNAguard適用的樣品包括：動物組織，培養(yǎng)細胞，昆蟲，及部分植物組織。這么嚴格的操作，是沒有多少實驗人員去認真執(zhí)行的。碾磨過程中要及時補充液氮以防止組織融化。RNAguard：抑制組織/細胞內(nèi)源酶的試劑綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。要考慮設(shè)備的線形范圍 （A260 要處于 – 之間）。純 RNA 的曲線具有如下特點：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個拐點，A300 接近 0，A260/A280 = 左右，A260/A230 = 左右。現(xiàn)實是，許多抽提 RNA 時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對 A260/A280 產(chǎn)生影響?，F(xiàn)在大家卻在拿 A260/A280 當‘因’用，認為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會產(chǎn)生困惑。首先要明確該指標用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 左右。使用非變性電泳檢測 RNA，以 DNA Marker 做對照，如果 2kb 處的 28S 和 處的 18S 條帶清晰，且 28S：18S 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗要求了。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎都得不到 2：1 的比例 （此結(jié)論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得）。1RNA 質(zhì)量的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。實驗表明，冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發(fā)生 RNA 的降解。冷凍的樣品抽提 RNA 前可能還要稱重，這個過程肯定會出現(xiàn)融化。1樣品凍融的影響冷凍的樣品可能較大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。這些特點決定了它們是非常強的酶抑制劑。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。4）植物組織：植物組織比動物組織更為復(fù)雜。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。但如果裂解液太粘稠 （因為核酸含量高的緣故），PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。3）核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。2）蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮狀物。這些組織細胞密度低，故單位重量的組織 RNA 的含量就少，最好用盡可能多的起始量。室溫靜置 510分鐘后，溶解。2）7080% 乙醇洗滌：洗滌時，一定要將核酸懸浮起來，才能保證殘留的鹽被洗去。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。決不能取到中間層。高速離心 2 分鐘?；谥x心式方法的最大問題是樣品過量。脂肪組
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