rna提取準備工作及注意事項(文件)
【正文】 保證殘留的鹽被洗去。這些組織細胞密度低，故單位重量的組織 RNA 的含量就少，最好用盡可能多的起始量。3）核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內含雜質導致。1樣品凍融的影響冷凍的樣品可能較大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。實驗表明，冷凍組織在融化過程中比新鮮組織更容易發(fā)生 RNA 的降解。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎都得不到 2：1 的比例 （此結論使用 Agilent Bioanalyzer 獲得）。首先要明確該指標用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/280 = 左右?，F實是，許多抽提 RNA 時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對 A260/A280 產生影響。要考慮設備的線形范圍 （A260 要處于 – 之間）。碾磨過程中要及時補充液氮以防止組織融化。RNAguard適用的樣品包括：動物組織，培養(yǎng)細胞，昆蟲，及部分植物組織。抽提前先用鑷子將組織從 RNAguard 中取出，在室溫進行切割和稱重后，移入裂解液中快速勻漿。使用 RNAguard 的操作非常簡單：在取組織前預先估計組織的重量，在一個容器中加入 510 倍體積的 RNAguard，放在手邊。這么嚴格的操作，是沒有多少實驗人員去認真執(zhí)行的。RNAguard：抑制組織/細胞內源酶的試劑綜上所述，確保 RNA 不降解的傳統做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。純 RNA 的曲線具有如下特點：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個拐點，A300 接近 0，A260/A280 = 左右，A260/A230 = 左右?，F在大家卻在拿 A260/A280 當‘因’用，認為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會產生困惑。使用非變性電泳檢測 RNA，以 DNA Marker 做對照，如果 2kb 處的 28S 和 處的 18S 條帶清晰，且 28S：18S 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗要求了。1RNA 質量的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。冷凍的樣品抽提 RNA 前可能還要稱重，這個過程肯定會出現融化。這些特點決定了它們是非常強的酶抑制劑。4）植物組織：植物組織比動物組織更為復雜。但如果裂解液太粘稠 （因為核酸含量高的緣故），PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。2）蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮狀物。室溫靜置 510分鐘后，溶解。將兩次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。高速離心 2 分鐘。脂肪組織要增加一步氯仿抽提。1：裂解細胞使 RNA 釋放出來 – RNA 如果不被釋放出來，得率是會降低的。9：徹底溶解
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