質(zhì)粒提取有關(guān)問題及注意點-wenkub
2023-04-10 04:08:43 本頁面
【正文】 ，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。洗脫時放置1min可達(dá)到較好的效果。1洗脫體積太?。合疵擉w積對回收率有一定影響。洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM TrisHCl, 1mM EDTA，)或水。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。而在泥水狀的菌液中你只要一湊過去就感覺到其臭無比或者沒有氣味，可以和正常菌液對照。解決辦法：降低培養(yǎng)溫度，在20～25℃下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。蘸了酒精后再燒一小會，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒還是干燒較長時間后，冷卻了再涂。使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。肉眼觀察活化菌株。 菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時) ：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。洗脫效率還取決于pH值。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。細(xì)菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發(fā)現(xiàn)菌體呈絮狀不均勻或呈細(xì)砂狀？參考見解：很可能是細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時間或者試試平板培養(yǎng)，質(zhì)粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養(yǎng)基上細(xì)菌生長的要好一些。菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高?？赡苁蔷看?，加溶液Ⅱ后，菌體并不能完全裂解，所以沒有變清，這也會導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)率低下．可能是質(zhì)粒的拷貝數(shù)不高，質(zhì)粒產(chǎn)率不高．如果是使用自己配的試劑，建議做中提或大提；或者買試劑盒提．用自己配的試劑，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干凈就要用比較好的ＲＮＡ酶。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是試劑盒，也要首先確認(rèn)溶液II是否澄清沒有沉淀？可能是細(xì)菌濃度很高，適當(dāng)調(diào)整增加溶液I/II/III的體積。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。8羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。加入異戊醇能降低分子表面張力，可以降低抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。參考見解：首先看看平衡酚是否已被氧化？？？有時由于溶液III配置的問題，這會降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差過大也會導(dǎo)致水相和平衡酚互溶。乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（殘留的鹽類會影響酶切）。提取質(zhì)粒中RNA沒有去除？可能是RNase失效或效率不高?？赡苁撬拗骶绊懙?，質(zhì)粒抽提好后，用酚氯仿處理一下再酶切，若有改善，則為宿主菌影響。雙酶切后跑膠一條帶都沒有，原因是什么？參考見解：溶解時間稍微短了點，但是根據(jù)各個實驗室RNase不同，這個條件是不同的。沒有用RNase消化，不要用放久的 RNase否則會有DNA酶的污染；在沒有進(jìn)行酶切時,把所提的質(zhì)粒跑一下核酸電泳看看,如果是提核酸的問題那這一步電泳結(jié)果應(yīng)該沒有大于三千的條帶,這樣可以先排除核酸提取的問題. 若是沒有酶切時間過長等其他問題的話可以那可以檢查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的問題，建議將超純水換成TE。培養(yǎng)基、抗生素、質(zhì)粒提取都沒有問題，而細(xì)菌菌液提取不到質(zhì)粒？參考見解：如果是氨芐抗性的，有可能是質(zhì)粒丟失造成的。轉(zhuǎn)帖過來和菜鳥分享。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）。／L，加抽提液時，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為ROSO3…R＋蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。10．為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。11．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。為了防止酚的氧化，％。去年做了半年載體構(gòu)建，連接無疑是其中重要的一關(guān)，根據(jù)自己的實驗心得和已有資料做個總結(jié)，希望對大家有用，同時希望戰(zhàn)友們批評指正！互相進(jìn)步！首先說說2片段連接通常是指目的片斷和載體片斷的連接，包括①小片段（目的片斷小于載體片斷的大?。┖洼d體片段的連接，這種情況多些，也比較容易連接，按照說明書要求的比例進(jìn)行即可，比如TAKARA的pMD19T Simple Vector連接時Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為1 ：2～10即可，如果效果不佳，檢測一下感受態(tài)細(xì)胞，如果片斷過小比如幾十bp，連接時要加大小片段的摩爾數(shù)，多連幾管，挑選白斑，以上是指雙酶切后的連接，即載體和目的片斷倆端的酶切位點相同；②大片段（目的片斷與載體片斷的大小差不多甚至大于載體的大?。┖洼d體片段的連接，目的片斷與載體片斷的大小差不多的情況應(yīng)盡量避免，因為這會給目的片斷膠回收帶來麻煩，我就遇到過這種情況，膠回收時很是費盡，最后勉強(qiáng)分開，當(dāng)然換個載體也許就解決問題了。Stbl3：克隆慢病毒表達(dá)載體中的正向重復(fù)序列，降低逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中長末端重復(fù)序列的非目標(biāo)同源重組。n 感受態(tài)細(xì)胞效價測定 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒：pUC18, pUC19,pBR322 超螺旋，超純 質(zhì)粒使用量
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