【正文】 提取知識儲備：216。 質(zhì)粒(Plasmid)是一種宿主染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。216。 質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對抗生素的抗性等。常見的天然質(zhì)粒有F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。216。 質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型: 緊密控制型(Stringent control)低拷貝和松馳控制型(Relaxed control)高拷貝。 前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時,它也不能復(fù)制,通常每個細(xì)胞內(nèi)只含有 1 個或幾個質(zhì)粒,如 BAC。后者的質(zhì)粒在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制,在每個細(xì)胞中有許多拷貝,一般在 20 個以上,如 pUC57,~200 copies。質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA的結(jié)構(gòu)差異來實現(xiàn)分離的。，線性DNA被徹底變性，但共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA雖然H鍵也發(fā)生斷裂，但兩條互補鏈仍會緊密纏繞結(jié)合在一起。，溶液恢復(fù)中性，質(zhì)粒DNA迅速復(fù)性，染色體DNA則由于變性而相互混亂纏繞，不能復(fù)性，從而離心即可以把變性的染色體DNA沉淀和蛋白SDS復(fù)合物沉淀分離出來。試劑成分：Buffer S1 (pH ) +RNase 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L TrisHCl (pH ) 10mmol/L EDTA (pH )Buffer S2 () 1%SDSBuffer S3() 3mol/L 乙酸鉀 冰醋酸(HAC,乙酸） 異硫氰酸胍或鹽酸胍質(zhì)粒檢測： 電泳檢測：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。 吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、280nm波長吸光值，若吸光值260nm/－，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，。Buffer S1的作用：161。 任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的p H，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的TrisHCl溶液，是再自然不過的了。161。 那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。161。 那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA.161。 如果哪天你手上正好缺了Buffer S1，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 Buffer S2的作用161。 Buffer S2用完后一定要把蓋子擰緊，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。161。 很多人不知道其實破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為 SDS也是堿性的，只是弱了點而已。161。 很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂?；蚪MDNA的斷裂會帶來麻煩。Buffer S3的作用161。 每個人都知道，Buffer S3加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。161。 最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在Buffer S2中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然 SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate，PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，Buffer S3加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA 自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。161。 那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是Buffer S3加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復(fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。 Buffer S3加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。