多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片斷-資料下載頁(yè)
2025-05-26 06:19本頁(yè)面
【正文】 ， 30s 72℃ ，1min PCR技術(shù) 高度靈敏， 為了避免外源 DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)， PCR操作時(shí)要注意做到： 注意事項(xiàng) ① 隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌； ② 分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭 （一）理論上 DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算 三、 課題成果評(píng)價(jià) 1 、 一條 DNA，復(fù)制 n次， DNA為 2 n 2 、 a條 DNA，復(fù)制 n次， DNA為 a x2 n （二）實(shí)驗(yàn)中 DNA含量的測(cè)定 1 、 原理 可以通過(guò)計(jì)算 DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果， DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰， 峰值的大小與 DNA的含量有關(guān) 稀釋 2μLPCR反應(yīng)液，加入 98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行 50倍稀釋 對(duì)照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 測(cè)定 取 DNA稀釋液 100μL至比色杯中，測(cè)定 260nm處的光吸收值 計(jì)算 DNA含量（ ?g /ml ）＝ 50 (260nm的讀數(shù)） 稀釋倍數(shù) 比色杯 PCR的突出優(yōu)點(diǎn) 快速 高效 靈活 易于 操作 四、 課題延伸 例如： PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍， 30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá) 230個(gè)拷貝（ 109拷貝） PCR的常見問(wèn)題 （一）出現(xiàn) 假陽(yáng)性結(jié)果 的原因： ①模板 DNA的污染是 PCR假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。 ②樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。 （二）出現(xiàn) 假陰性結(jié)果 的常見原因： ① Taq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制； ②提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過(guò)關(guān) ③ PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)； ④引物設(shè)計(jì)不合理； ⑤循環(huán)次數(shù)不夠；等等。 五、實(shí)驗(yàn)小結(jié) PCR儀加熱使 （ ） 變性 , 復(fù)性使引物與模板 DNA（ ） ,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫 ( ),在 （ ） 的作用下 ,以 （ ） 為原料 ,以 （ ） 為復(fù)制的起點(diǎn) ,合成新鏈 。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度 ,經(jīng) （ ） 三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán) ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍 ,一般樣品是經(jīng)過(guò) 30次循環(huán) ,最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍 。 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳 ,經(jīng)溴化乙錠染色 ,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的 DNA帶 。 模板 互補(bǔ) Taq聚合酶四種脫氧核苷酸 引物 變性、復(fù)性和延伸 72℃：繪圖可參考教科書中圖 59。 PCR反應(yīng)中的目的片段一般以 2n的方式積累，其中 n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè) DNA片段在 30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有 10億個(gè)這樣的片段 （ 2n= 230= 1 073 741 824)。 ： PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo) DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，感興趣的學(xué)生可以參考 《 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 》 （見本專題參考書目），書中有詳盡的論述。 書后題
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