多聚酶鏈式反應擴增dna片斷-資料下載頁
2025-05-26 06:19本頁面
【正文】 ， 30s 72℃ ，1min PCR技術 高度靈敏， 為了避免外源 DNA等因素的污染而造成干擾實驗， PCR操作時要注意做到： 注意事項 ① 隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌； ② 分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭 （一）理論上 DNA擴增數(shù)目的計算 三、 課題成果評價 1 、 一條 DNA，復制 n次， DNA為 2 n 2 、 a條 DNA，復制 n次， DNA為 a x2 n （二）實驗中 DNA含量的測定 1 、 原理 可以通過計算 DNA含量來評價擴增的效果， DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰， 峰值的大小與 DNA的含量有關 稀釋 2μLPCR反應液，加入 98L蒸餾水，即將樣品進行 50倍稀釋 對照調零 以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零 測定 取 DNA稀釋液 100μL至比色杯中，測定 260nm處的光吸收值 計算 DNA含量（ ?g /ml ）＝ 50 (260nm的讀數(shù)） 稀釋倍數(shù) 比色杯 PCR的突出優(yōu)點 快速 高效 靈活 易于 操作 四、 課題延伸 例如： PCR產物每輪循環(huán)增加一倍， 30輪循環(huán)擴增量達 230個拷貝（ 109拷貝） PCR的常見問題 （一）出現(xiàn) 假陽性結果 的原因： ①模板 DNA的污染是 PCR假陽性結果的主要原因。 ②樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽性結果。 （二）出現(xiàn) 假陰性結果 的常見原因： ① Taq DNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制； ②提取的模板質量或數(shù)量不過關 ③ PCR系統(tǒng)的建立欠妥當； ④引物設計不合理； ⑤循環(huán)次數(shù)不夠；等等。 五、實驗小結 PCR儀加熱使 （ ） 變性 , 復性使引物與模板 DNA（ ） ,延伸需將反應溫度升至中溫 ( ),在 （ ） 的作用下 ,以 （ ） 為原料 ,以 （ ） 為復制的起點 ,合成新鏈 。 如此重復改變反應溫度 ,經(jīng) （ ） 三個階段為一個循環(huán) ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍 ,一般樣品是經(jīng)過 30次循環(huán) ,最終使基因放大了數(shù)百萬倍 。 將擴增產物進行電泳 ,經(jīng)溴化乙錠染色 ,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的 DNA帶 。 模板 互補 Taq聚合酶四種脫氧核苷酸 引物 變性、復性和延伸 72℃：繪圖可參考教科書中圖 59。 PCR反應中的目的片段一般以 2n的方式積累，其中 n為反應循環(huán)次數(shù)。一個 DNA片段在 30次循環(huán)后反應物中大約有 10億個這樣的片段 （ 2n= 230= 1 073 741 824)。 ： PCR引物是根據(jù)需要擴增的目標 DNA的堿基序列來設計的。引物的設計需要豐富的分子生物學實驗經(jīng)驗，感興趣的學生可以參考 《 分子克隆實驗指南 》 （見本專題參考書目），書中有詳盡的論述。 書后題
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