聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-20xx分子生物學(xué)-資料下載頁
2025-01-16 22:18本頁面
【正文】 A (使 dNTP 聚合 ) PCR 二、實(shí)時(shí) PCR 實(shí)時(shí) PCR（ realtime polymerase chain reaction）又稱熒光定量 PCR。是指在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加，利用熒光信號積累 實(shí)時(shí) 監(jiān)測整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行 定量分析 的方法。 ? 熒 光定量 PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的 PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。 ? 實(shí)時(shí) PCR(realtime PCR)技術(shù)通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量 PCR，得到廣泛應(yīng)用。 ? 熒光定量 PCR標(biāo)記方法： 序列特異性探針：如 Taqman 內(nèi)摻式染料：如 SYBR Green I PCR引物 ?實(shí)時(shí) PCR技術(shù)原理 引物之間一段帶有標(biāo)記寡核苷酸鏈，稱作探針 報(bào)告基團(tuán) 淬滅基團(tuán) 無熒光信號產(chǎn)生 能量 激發(fā)光 完整的探針： 5′端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的 3′端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移） 變性 (95186。C) 退火 (60186。C) 退火 (60186。C) ? ? 5′→ 3′外切酶活性 ? 將探針 5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來 ?實(shí)時(shí) PCR技術(shù)原理 Q R 339。 339。 539。 539。 上游引物 下游引物 熒光標(biāo)記分子 R Q 339。 339。 539。 539。 熒光報(bào)告分子 熒光淬滅分子 熒光信號 SYBR Green I作用機(jī)理 Emission Emission SYBR Green I作用機(jī)理 Excitation Emission 原位 PCR(In Situ PCR,ISPCR)是 利用完整的細(xì)胞作為一個(gè) 微小的反應(yīng)體系 來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi) 進(jìn)行原位擴(kuò)增目的片段 ,在不破壞細(xì)胞的前提下 ,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行定性定量 定位 分析。 即 把 原位雜交 的細(xì)胞定位技術(shù)與 PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)。 三、原位 PCR ▲ 待檢標(biāo)本先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的 通透性 ， PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物， DNA聚合酶， dNTP等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)。 ▲ 以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的 RNA或 DNA為模板 ，于 原位 進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，被保留在原位。使原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定 DNA或RNA序列在原位以呈 指數(shù)擴(kuò)增 ，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 ▲ 使用專用原位 PCR的儀器。 用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的 DNA片段對某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 對 未知序列 擴(kuò)增后進(jìn)行分析 ,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長 cDNA的克隆 ,擴(kuò)增基因文庫的插入 DNA； 已知序列 未知序列 未知序列 四、反向 PCR 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 未知序列 已知序列 ? 不對稱 PCR 用 不等量 的一對引物擴(kuò)增后產(chǎn)生 大量的單鏈 DNA（ ssDNA） 。 ? 這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為 50～ 100∶ 1。在 PCR反應(yīng)的最初 10～ 15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈 DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物 )消耗完后，非限制性引物 (高濃度引物 )引導(dǎo)的 PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈 DNA。 ? 產(chǎn)生的 dsDNA與 ssDNA由于分子量不同可以在電泳中分開，而得到 純 ssDNA。 ? 主要為測序制備 ssDNA，為了制備探針。 五、不對稱 PCR 高濃度引物 低濃度引物 ? 巢式 PCR（ nested PCR），利用兩套 PCR引物對（巢式引物）進(jìn)行兩輪 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 ? 第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。 六、巢式 PCR P1 P2 P3 P4 ? 巢式 PCR的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。 ? 巢式 PCR可以增加有限量靶序列 （ 如稀有 mRNA） 的靈敏度 ， 并且提高了 特異性 。 ? 彩色 PCR（ Color plement assay）是用 熒光染料標(biāo)記引物的 5’端。 ? 熒光染料 JOE和 FAM呈綠色熒光； TAMRA呈紅色熒光； COUM呈藍(lán)色熒光。 ? 不同熒光標(biāo)記的引物同時(shí)參加反應(yīng)，擴(kuò)增后的目的基因會分別帶有引物 5’端的染料，通過電泳就可以根據(jù)不同熒光的色澤 直觀 判斷目標(biāo)基因是否存在及擴(kuò)增基因的類型。 ? 可用于基因診斷，如診斷基因缺失、染色體易位或感染某種病毒。可用 更多的色彩 ，同時(shí)檢測 多種基因成分 。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 七、彩色 PCR 標(biāo)記引物 ＰＣＲ 觀察 PCR產(chǎn)物
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