多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片斷(存儲(chǔ)版)
【正文】 30次 94℃ ， 30s 55℃ ， 30s 72℃ ，1min 最后 1次 94℃ 1min 55℃ ， 30s 72℃ ，1min PCR技術(shù) 高度靈敏， 為了避免外源 DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)， PCR操作時(shí)要注意做到： 注意事項(xiàng) ① 隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌； ② 分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭 （一）理論上 DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算 三、 課題成果評(píng)價(jià) 1 、 一條 DNA，復(fù)制 n次， DNA為 2 n 2 、 a條 DNA，復(fù)制 n次， DNA為 a x2 n （二）實(shí)驗(yàn)中 DNA含量的測(cè)定 1 、 原理 可以通過計(jì)算 DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果， DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰， 峰值的大小與 DNA的含量有關(guān) 稀釋 2μLPCR反應(yīng)液，加入 98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行 50倍稀釋 對(duì)照調(diào)零 以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零 測(cè)定 取 DNA稀釋液 100μL至比色杯中，測(cè)定 260nm處的光吸收值 計(jì)算 DNA含量（ ?g /ml ）＝ 50 (260nm的讀數(shù)） 稀釋倍數(shù) 比色杯 PCR的突出優(yōu)點(diǎn) 快速 高效 靈活 易于 操作 四、 課題延伸 例如： PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍， 30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá) 230個(gè)拷貝（ 109拷貝） PCR的常見問題 （一）出現(xiàn) 假陽性結(jié)果 的原因： ①模板 DNA的污染是 PCR假陽性結(jié)果的主要原因。一般 GC含量每增加 1%，解鏈溫度增加 ℃ 。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對(duì)，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對(duì) 利用堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律的計(jì)算 規(guī)律一： DNA雙鏈中的兩條互補(bǔ)鏈的堿基相等，任意兩個(gè)互補(bǔ)的堿基之和相等即 A=T， G=C。任意兩個(gè)不互補(bǔ)的堿基之和恒等，占?jí)A基總數(shù)的 50%。哺乳動(dòng)物基因組 DNA中 GC含量在 40%時(shí)，解鏈溫度約為 87℃ ；其含量在 60%時(shí)， 解鏈溫度約為 95℃ 。 ②樣品中存在靶基因的同源序列也可能造成假陽性結(jié)果。 ： PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo) DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)的。 PCR反應(yīng)中的目的片段一般以 2n的方式積累，其中 n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出 PCR技術(shù)的特點(diǎn) 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外 DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別 體內(nèi) DNA的復(fù)制 體外的模擬 模板（母鏈） 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物 dNTP 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 聚合酶 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 反應(yīng)環(huán)境 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 緩沖液 ① PCR過程需要的引物是 RNA或 DNA，而是人工合成的 DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為 20－ 30個(gè)脫氧核苷酸 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和 PCR不同點(diǎn) ② PCR過程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對(duì)反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的 細(xì)胞內(nèi) DNA的復(fù)制 PCR 不同點(diǎn)
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