實驗二-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定-資料下載頁
2025-08-04 15:22本頁面
【正文】 。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可以有很多原因，首先考慮是DNA本身的原因如DNA不純、缺少識別序列、DNA甲基化等，另外限制性內(nèi)切酶部分失活，酶存在星號活性，反應(yīng)條件不合適等，都會使DNA酶切失敗。酶切后除了目的DNA條帶外，還有其它條帶。酶存在“星號”活性或其它內(nèi)切酶污染使底物產(chǎn)生非特異切割。在進(jìn)行PCRRFLP時，設(shè)置陽性對照十分重要，以便在實驗中查明失敗原因。因此，在設(shè)計一個PCRRFLP實驗的時候，應(yīng)該先尋找突變前后存在的自然酶切位點(diǎn)，當(dāng)沒有這樣的位點(diǎn)存在時，可以通過設(shè)計引物引入特定的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。在應(yīng)用RFLP檢測點(diǎn)突變時可能會引起假陽性，特別是在發(fā)生缺失突變時，酶切位點(diǎn)消失，目的片段不能夠被切開，在進(jìn)行臨床診斷的時候要特別注意。第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)目的：掌握瓊脂糖凝膠電泳基本操作原理：瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對遷移率有影響，如共價閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)雙鏈DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA（球形）不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對遷移率大于0。在電泳過程中，凝膠中的溴化乙錠(EB)嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EBDNA復(fù)合物發(fā)出橙紅色熒光。試劑：（1）瓊脂糖（2）TBE（HCl，，）（3）溴化乙錠（EB）操作步驟：（1）凝膠制備: 用TBE緩沖液配制1％瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時加入溴化乙錠（EB），然后將其注入玻璃板或有機(jī)玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1mm處。（2）樣品制備與加樣：將DNA溶液按5:1溶解于6Loding Buffer緩沖液中，上樣于瓊脂糖凝膠孔中。（3）電泳：一般電壓為515V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進(jìn)行。
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