【正文】 539。539。CA A CT GSS539。GT T G ACS339。 G AC S339。539。 339。CA A CT GSS539。GT T G ACS339。 G AC 339。539。 339。CA A CT GSSHi n cI I539。GT T GA C339。 539。 339。339。 339。339。339。 339。339。 339。339。339。AAA ...A339。RT引物25 39。339。 539。 539。 3 39。5 39。RNa seHRT539。3 39。539。3 39。引物1539。T7 RNA po l引物2 + RT反義RNA3 39。339。RNa seH引物2539。339。5 39。 例如 AIDS的診斷，常規(guī)方法是利用血清背景和病毒培養(yǎng)，往往需要 34個(gè)星期，采用 PCR技術(shù)則只需一天左右，且準(zhǔn)確率高 根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì) PCR引物 ,可直接在不同的樣品中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ,而不必分離純化生物樣品 4. 基因突變 1）缺失突變 2）插入突變 3）點(diǎn)突變 單點(diǎn)和多點(diǎn)突變 六 . 等溫 3SR(selfsubstained sequence replication)反應(yīng)系統(tǒng) 七 . 等溫鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng) (SDA, strand displacement amplification) T7 RNA po l引物1 + RT539。 利用 PCR技術(shù)和限制酶譜分析診斷此分子疾病大致過(guò)程如下： DNA擴(kuò)增 PAGE 染色 觀察 比較不同個(gè)體的結(jié)果 限制酶切 PAGE 染色 觀察 此法可在 34 h獲得結(jié)果，比常規(guī)的 Southern雜交法簡(jiǎn)便、快速。 SP6 T7PC R IPC R IIPC R II I四 . 定量 PCR技術(shù) 1. 基本原理 N=N0(1+eff)n N最終拷貝數(shù)； N0起始拷貝數(shù)； eff擴(kuò)增效率； n擴(kuò)增次數(shù) 2. 測(cè)定方法 競(jìng)爭(zhēng) PCR法 (加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)物 )； RTPCR轉(zhuǎn)錄法 五． PCR技術(shù)的應(yīng)用 1. 遺傳疾病的診斷 人類鐮刀型貧血癥是因第六個(gè)密碼子的第二個(gè)字母發(fā)生了A→T 的改變，從而導(dǎo)致該位點(diǎn)的谷氨酸為纈氨酸所取代 。 5’539。539。 5’539。5’539。變性/復(fù)性啟動(dòng)子與基因1編 碼區(qū)同源PCR539。 與基因2啟 動(dòng)子同源基因1編碼區(qū)PCR539。339。539。 539。 339。 539。 339。 TTT ...TTdT + d GT PGG. .GCC. .C 限 制酶識(shí)別序列 限 制酶識(shí)別序列 PCR(Addon PCR) 在合成引物時(shí)加上研究者所需要的核苷酸序列，如某種限制酶的識(shí)別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列 PCR（ mismatched PCR) 利用該法可在一已知 DNA序列中引起點(diǎn)突變，缺失突變和插入突變。RT539。539。539。TTT ...T539。AAA ...A539。TTT ...T5 39。AAA ...A539。TTT ...T5 39。AAA ...ARNa seH539。 TTT ...T5 39。 339。 X Z R2 R1 P1 Z R2P2 PCR(reverse transcription PCR, RTPCR) 主要用于 mRNA的 PCR擴(kuò)增 mRN A引物1539。如用于檢測(cè)鐮刀形貧血癥。該法可用于測(cè)定某一 DNA片段上是否帶有某一已知堿基置換。4. 連結(jié) PCR(ligation mediated PCR) 該法可用于核苷酸序列測(cè)定 ,DNA足跡分析技術(shù)和測(cè)定甲基化作用 DNa seI 變性、引物 鏈延伸 加接頭（引物） 外側(cè)引物 內(nèi)側(cè)引物 連接引物 標(biāo)記引物5. 不對(duì)稱 PCR(Asymmetrical PCR) 采用不同引物濃度比率，如 50： 1， 100： 1，可得大量拷貝的ssDNA用于測(cè)序 6. GC串 PCR (GC clamp PCR) 應(yīng)用 變性劑梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)可檢測(cè)出 DNA片段中一對(duì)堿基的變化，在 DNA分子一端加上一 GC串（約 40 .）利用它的高解鏈溫度特性，在梯度變性膠上可檢測(cè)出原 DNA鏈中最高解鏈區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變 539。 G. . .G 339。539。 G. . .G 339。539。 G. . .G 339。PCR TdTdG T P539。 339。 539。 3. 錨定 PCR(Anchored PCR， APCR) 539。 三． PCR方法 1. 強(qiáng)化 PCR（ Boosted PCR） 將 PCR分為兩個(gè)階段： 1）引物與模板之比為 107，擴(kuò)增 20個(gè)周期 2）引物與模板之比為 1012 –1013，再擴(kuò)增 10個(gè)周期 該法適合于待擴(kuò)增 DNA濃度較低時(shí)。 ***3） 鏈延伸長(zhǎng)度與延伸時(shí)間有關(guān) ，對(duì)于 Taq DNA聚合酶，每分鐘可形成 2022 。 引物的長(zhǎng)度常為 2028聚體，其中有 50%以上的 GC含量，無(wú)自身互補(bǔ)序列，特別是 339。 *注： 1）退火溫度常與引物的長(zhǎng)度和堿基組成有直接相關(guān)關(guān)系， 引物越長(zhǎng)或GC含量較高，退火的溫度可以高些 ， 反之則低 些。這對(duì)于 PCR技術(shù)的可靠性是至關(guān)重要的。利用 T7 DNA聚合酶 ，可使擴(kuò)增片段達(dá) 2 Kb。研究表明，利用 Klenow片段進(jìn)行 20次擴(kuò)增后進(jìn)入平臺(tái)期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為 2 105，當(dāng)采用 Taq DNA聚合酶時(shí)，擴(kuò)增 25次后才進(jìn)入平臺(tái)期，拷貝數(shù)可大 4 106 ***4） 延伸長(zhǎng)度 ：有時(shí)為了獲取較長(zhǎng) DNA片段的擴(kuò)增，這就要求 DNA聚合酶具有較強(qiáng)的延伸能力。顯然，其產(chǎn)物的專一性大大降低，使結(jié)果無(wú)法分析。HCl 4. 最佳二價(jià)陽(yáng)離子 Mg2+ （ 10 mM） 5. 具良好的熱穩(wěn)定性：在 90℃ 下連續(xù)反應(yīng) 30分鐘仍有 70%的酶活 50 100 150 溫度摻入的HdNTTP微克分子數(shù)3相對(duì)酶活的分率20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95℃ 90℃ 70℃ 反應(yīng)時(shí)間（分）摻入的HdNTTP微克分子數(shù)320 40 60 80 25 50 75 Mg二價(jià)陽(yáng)離子濃度（mM )Mn