【文章內容簡介】 *?T 60 GTAC TATA TCGA TGCA TTAA A****?T Nsi I C?****G Bsi WI SfcI X h o I AvaI AvaI SfcI C*?***G C**?**G C***?*G C****?G PstI G?****C Asp718BanI Sal I ApaLI 61 GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G*?***C AccI AccI G**?**C Bsrl107I HincII HpaI HincII G***?*C G****?C KpnI Bsp1286 HgiAI T?****A T*?***A BstBI T**?**A DraI T***?*A T****?A 62 4. 限制性內切酶酶解反應中的注意事項 ① 大多數(shù)廠家供應的限制內切酶為濃縮液 1U的酶液足以在 1h內消化 10μg DNA ，酶和底物比例 210U/ug DNA,避免使用過高的酶濃度 ② 濃縮液使用前可用 1限制酶緩沖液稀釋 ③ 限制性內切酶在含 50%的甘油的緩沖液 中，于 20℃ 穩(wěn)定保存 63 ④ 酶分裝成小份，避免反復凍融 ⑤ 反應中盡可能少加水，使反應體積減到最低 ⑥ 通常增加反應時間，可降低酶量 64 DNA中的雜質如 蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、 EDTA等都會影響酶的活性。 1. DNA的純度 五、影響限制性內切酶活性的因素 ①純化 DNA ②加大酶的用量， 1ugDNA用 10U酶 ③延長保溫時間 ④擴大反應體積（ 20?l） 一般采取 65 需要合適的底物： 底物（ DNA）純度要高 .不能含有 RNA和蛋白質 。也不能含有過高的 EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、 SDS和其他有機試劑。 DNA的濃度 不宜過高，高濃度的 DNA會使溶液的粘度增加從而抑制酶分子的擴散導致酶切反應不徹底。常為 50ul內含 1ug DNA。 66 大腸桿菌一般有 兩種甲基化酶 修飾質粒： 2. DNA的甲基化程度 DNA腺嘌呤甲基化酶 （ DNA adenine methylas ,dam) （修飾 GATC中的 A）； DNA胞嘧啶甲基化酶 （ DNA cytosine ethylas ,dcm)（修飾 CCA/TGG的 C）。 基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。 67 不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。 大多數(shù)是 37 oC，少數(shù)要求 4065 oC。 每微克 DNA用 1～ 5單位的酶，保溫 1~2小時。 酶 最適溫度 oC 酶 最適溫度 oC 酶 最適溫度 oC Apa I Bcl I Mae II Taq I 30 50 50 65 Apy I BstE II Mae III 30 60 55 Ban I Mae I Sma I 50 45 25 3. 溫度 68 是影響限制酶活性的重要因素 4. 緩沖液 (Buffer) （ 1）緩沖液的化學組成 MgCl NaCl/KCl： 提供 Mg2+和離子強度 TrisHCl： 維持 pH,大多數(shù)為 二硫蘇糖醇（ DTT）： 防止酶氧化 ,保持酶穩(wěn)定性 牛血清白蛋白（ BSA）等：中性蛋白質 ,防止酶在低 濃度的蛋白質溶液中變性 商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液 69 （ 2）兩種或兩種以上的酶切割 DNA樣品 ① 在相同的緩沖液中反應同時進行 ② 若需要不同的緩沖液 ,采用 3種方法 ⅰ) 先用要求 低 離子強度的酶切割（低鹽酶） ,再加 NaCl調節(jié) 離子強度 ,并用第二種酶切割（高鹽酶）； ⅱ) 先用 一種 酶切割 ,然后用 , 再重懸于另一種緩沖液中進行第二種酶切割； ⅲ) 使用所有 限制性酶的 通用 buffer,如 KGB(谷氨酸鉀 buffer),經適當稀釋可達到各種限制性酶要求的 buffer條件。 70 練習題 何為限制性內切酶？有哪些類型，各有什么作用和特點 什么是限制性內切酶的星號活性？受哪些因素影響？ 限制性核酸內切酶是由細菌產生的，其生理意義是 【 】 Ａ 修復自身的遺傳缺陷 Ｂ 促進自身的基因重組 Ｃ 強化自身的核酸代謝 Ｄ 提高自身的防御能力 Ｅ 補充自身的核苷酸消耗 71 從細菌 DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條 DNA雙鏈連接到一起的酶。 第二節(jié) DNA 連接酶 一、 DNA連接酶（ ligase)的發(fā)現(xiàn) DNA復制一定有斷口 72 DNA連接酶 : 一種能夠催化在兩條 DNA鏈之間形成 磷酸二酯鍵 的酶 1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在 2條 DNA鏈之間形成 磷酸二酯鍵 的酶，即 DNA連接酶。 73 （ 1）大腸桿菌連接酶 1. 兩種共價連接 DNA限制片段的 DNA連接酶 只能連接 粘性末端，背景低，準確性高 二、 DNA ligase的特點 （ 2） T4噬菌體的連接酶 不但能連接粘性末端；還能連接 齊平末端 74 （ 1）必須是兩條 雙鏈 DNA （ 2） DNA3’端有游離的 OH， 5’端有一個磷酸基團（ P） （ 3）需要 能量 動物或噬菌體中： ATP 大腸桿菌中： NAD+ 2. 連接條件 75 （ 4） DNA連接酶的反應條件 TrisHCl 50 100 mM， pH MgCl2 10 mM ATP 1 mM DTT 5 mM Volume 10 20 ml T T 4 15 ℃ ， 4 16 hr 1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下 15 ℃反應 1 小時，完全連接 1 ?g lDNA（ Hind Ⅲ 片段）所需的酶量。 76 1. ATP（ NAD+)提供激活的 AMP。 三、連接反應的機理 2. AMP與連接酶形成共價“ 連接酶 AMP”復合物，并釋放出焦磷酸 PPi （ NMN） 。 3. AMP與連接酶的 賴氨酸 ?氨基 相連。 OCCCH2CH2CH2CH2NH2+ +H3N AMP ATP PPi 77 4. AMP隨后從連接酶的 賴氨酸 ?氨基轉移到 DNA一 條鏈的 5’端 P 上，形成“ DNA腺苷酸 ”復合物。 OH HOP AMP OH OP AMP 78 5. 3’ OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，釋放出 AMP。 79 如何連接由限制性內切酶切割形成片斷的末端 ？ 80 連接酶反應的最佳溫度是 37?C。 四、連接反應的溫度 1. 最佳溫度 但在 37℃ 下 粘性末端 的結合很不穩(wěn)定。 2. 實用溫度 所以一般采用 4~16?C 81 增加插入片段與載體的接觸機會，減少同一個分子末端自我連接的現(xiàn)象。 1. DNA末端的濃度 五、影響連接反應的因素 10~20倍 2. 插入片段與載體的濃度比例 兩種構型：線狀分子和環(huán)狀分子 與 DNA濃度 及 DNA分子長度 相關 82 3. 反應溫度 黏性末端： 12～ 16℃ 平頭末端： 10～ 20℃ 4. ATP濃度 一般， ATP最適的終濃度為 ATP濃度高至 5mmol/L，影響平頭末端的連接 ATP濃度高至 ，抑制粘性末端及平頭末端的連接。 83 六、 DNA連接的反應體系 酶切純化后的 DNA片斷 連接緩沖液 DNA連接酶 84 從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多。 七、 平頭雙鏈 DNA片段的連接操作 85 加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 加入 10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用 加入單價陽離子（ NaCl），最終濃度 150200 mM 提高平頭末端連接效率的方法包括： 86 第三節(jié) DNA聚合酶 DNA聚合酶（ DNA polymerase) 能在 引物 和 模板 的存在下，把脫氧核糖多核苷酸連續(xù)地加到 雙鏈 DNA分子 引物鏈的 3’－ OH末端，催化核苷酸的聚合作用 . 87 一、基因工程中常用的 DNA聚合酶 DNA聚合酶 . Klenow fragment . T7 DNA聚合酶 . T4 DNA聚合酶 . 修飾過的 T7 DNA聚合酶 . 逆轉錄酶 DNA聚合酶 88 1. 共同特點 把 dNTPs連續(xù)地加到引物的 3’－ OH端 2. 主要區(qū)別 T7 DNA聚合酶 可以連續(xù)添加數(shù)千個 dNTPs而不從模板上掉下來。 其它幾種 DNA聚合酶只能連續(xù)添加 10多個 dNTPs就會從模板上解離下來。 二、常用的 DNA聚合酶的特點 持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 89 DNA聚合酶 3’ ?5’外 切酶活性 5’ ?3’外切酶活性 聚合速率 持續(xù)能力 大腸桿菌 DNA聚合酶 低 有 中 低 Klenow fragment 低 無 中 低 T4 DNA聚合酶 高 無 中 低