【正文】 3. 為什么 DNA可以采用凝膠電泳法進(jìn)行分離分析 ? 演講完畢，謝謝觀看！ 。 * 166 5’ ……ATCGCGAT GAATT CGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTA C TTAAGCGCTA …… 5` OH OH P P 3` 5` 3` 5` 5’ ……ATCGCGAT GAATTCGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTA CTTAAGCGCTA …… 5 ligase * 167 * 168 二、連接方法 1. 連接粘末端 . ? 將 ddH2O， buffer，兩 DNA片段， T4 DNA ligase混合 12℃ 下 8 h . ? 只能用 T4 DNA ligase. * 169 5’ ……ATCGCGAT CGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTA GCGCTA …… 5` OH OH P P 3` 5` 3` 5` 5’ ……ATCGCGATGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTACGCTA …… 5 T4 DNA ligase ATP * 170 課后習(xí)題 1. 說明 PCR的反應(yīng)體系的組成及基本過程。 * 165 常用的 DNA連接酶 ? E. coli DNA ligase：只連接黏末端。 * 160 (7)、 DNA片段大小的確定 ? 將已知大小的 DNA marker與待測的 DNA片段在同一板膠上電泳，根據(jù) DNA marker的大小來推斷待測 DNA大小。 ? 注意事項： ? 紫外可傷眼睛皮膚等， 應(yīng)戴面罩 。 * 158 (5)、電泳 ? 加樣孔在負(fù)極，接通電源， 90v 電壓電泳。 * 157 (4)、加 DNA樣品 ? 電泳槽加滿 TAE緩沖溶液，放入制好的凝膠，浸入溶液中。 ? 倒入制膠平臺上，插入梳子。 * 150 凝膠濃度過大時 * 151 凝膠濃度適中 * 152 凝膠濃度過小 * 153 高濃度凝膠，適合小分子DNA * 154 低濃度凝膠，適合大分子DNA * 155 DNA片段大小（ kb） 瓊脂糖含量 （ %） 80 * 156 (3)、凝膠的配置 ? 例如配制 1%的凝膠： ? 稱 20mL TAE緩沖溶液，混均， ? 加熱熔化（微波爐）。 * 145 1 2 實 例 * 146 二、電泳方法： Agarose gel electrophoresis 瓊脂糖凝膠電泳 (分離范圍 : 70bp80kb） Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (分離范圍 : 6bp1kb) * 147 瓊脂糖凝膠電泳 * 148 （ 1）、緩沖溶液（ Buffer） ? 一種溶液可同時用于電泳和凝膠制備。 * 143 凝膠 ?固體 DNA不會丟失 ?固體 提供阻力 * 144 DNA可以被染色觀察 ? 可見光下 DNA無色。 大小相同 ： ?超螺旋結(jié)構(gòu)最快， ?環(huán)狀結(jié)構(gòu)次之， ?線性結(jié)構(gòu)最慢。 ? 電泳： 在外電場作用下，由于離子所帶電荷大小和性質(zhì)不同，其泳動方向和速率也不同，從而達(dá)到分離的目的。 2 點雜交 ? 當(dāng)擴增產(chǎn)物是多條帶時，用點雜交更合適 3 序列測定 ? 最準(zhǔn) * 139 4 其他： 微孔板夾心雜交法、 PCRELISA法、 顏色互補分析法、 單一核苷酸引物延伸法 PCROLA * 140 第五節(jié) 凝膠電泳分析 DNA片段 Analysis of DNA fragment by gel electrophoresis 一、核酸電泳的原理： 1. 核酸是兼性離子，具有等電點 (DNA 4~， RNA 2~)。 ? ③用一次性移液器或吸頭。 * 137 (3) 改進(jìn)實驗操作 : ? ① 戴一次性手套操作。 ? 引物 不能高壓， 用滅菌的去離子水在無菌條件下配制 。 * 136 2 污染的預(yù)防 ? (1) 隔離不同操作區(qū)： 前處理、后處理在不同隔離工作臺或房間進(jìn)行。 * 134 強大擴增能力，檢測敏感 極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性。 ? 4 循環(huán)次數(shù) : ? 2530個足夠。 ? 時間過長，非特異性增加。 ? 溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。 * 130 退火 (annealing) 溫度與時間 ? 通常 3755℃ 、 30s~2min。 * 128 四 . PCR的優(yōu)化 * 129 變性溫度和時間 ? 變性不完全 —— 失敗。 ? 進(jìn)入平臺期的原因： ? 模板 DNA過量 ? 引物或 dNTP的量不足。 ? 4種 dNTP濃度應(yīng)相同。 ? 濃度過高易形成引物二聚體，濃度過低，降低 PCR的產(chǎn)率 . * 123 * 124 PCR反應(yīng)體系的其他成分 （ 1） 緩沖溶液 ? 1050mmol/L TrisHCl（ , 20℃ ） （ 2） Mg2+： ? 為提高 Taq DNA聚合酶的活性 ? 含量：低 :低活性，高 :非特異性擴增 * 125 （ 3） dNTPs（ dATP、 dTTP 、 dGTP 、 dCTP） ? 貯備 dNTPs液： 1mol/L NaOH 調(diào) pH至中性。 保存 ? 凍干引物于 20℃ 可保存 12年，液體狀態(tài)于20℃ 可保存 6個月。 * 119 5` end determine the length of the PCR product. * 120 (6)、序列的特異性 ? 利用已知序列設(shè)計引物，擴增未知 DNA片段時，已知序列在引物區(qū)的序列同源性應(yīng)盡可能大，小于 70%就可能出現(xiàn)非特異性擴增。 真菌、細(xì)菌直接提取菌體 DNA 對于 RNA樣品 ，首先 需 要 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA才能進(jìn)行 PCR擴增 ， DNA遠(yuǎn)比 RNA穩(wěn)定 。 * 114 4 Tth DNA聚合酶 ? 有 5‘→3’ 聚合酶活性，無 3‘→5’ 外切酶活性， ? 在有 Mn離子時有反轉(zhuǎn)錄酶活力，有 Mg離子時可進(jìn)行 PCR擴增。 ?可擴增 DNA片段的長度 5kb。 ? 保存 :在 20℃ 至少 6個月。 ? 內(nèi)源 DNA: 不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細(xì)菌 DNA或 PCR產(chǎn)物的 污染而含有不明來源的 DNA。 如何避免錯配？ 使用有校對功能的酶。 沒有校正 單核苷酸錯配 功能 致命弱點。 * 109 三、 PCR 反應(yīng)成分及功能 （一）、 DNA聚合酶的選擇 1. Klenow DNA 聚合酶 : 缺點 : ① 受熱失活； ②產(chǎn)物混合其他 DNA分子； ③產(chǎn)物混合大量雜蛋白 ④擴增 DNA小于 400bp. * 110 Taq DNA polymerase 1969年，美國黃石國家公園溫泉中分 已克隆了該酶基因，表達(dá)蛋白已成功純化，其分子量為94 kD ① 、活性： 在幾種水棲熱菌中活性最高， 200 000U/mg ② 、離子需要：對 Mg2+ ，單價離子（ K+ 或 NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。 （ 4）結(jié)果分析：采用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果。 （ 2） 模板（ template） DNA的提取。 ?多重 PCR （ MultiplexPCR）：多對引物，同時擴增多條 DNA片段。 ?這種熱變性 退火 延伸的過程就是一個 PCR循環(huán)， PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。耐熱 DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動化 . * 88 二、 PCR的原理 ?類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制。 發(fā)展過程： 開始使用大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性 DNA后都要重新補加。 * 85 PCR的發(fā)明 PCR （ Polymerase Chain Reaction）技術(shù)是1983年由美國 CETUS公司的 Karry Mullis博士發(fā)明的，它是分子生物學(xué)在技術(shù)上的一次革命 . * 86 6070年代有科學(xué)家 Khorana提出 “ 經(jīng)過 DNA變性，與合適引物雜交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆 tRNA基因 ” 。 ? PCR獲得的 DNA可切割、連接、測序。 * 84 PCR功能強大 ? PCR 可在 2小時內(nèi)獲得足夠多的 DNA片段。 Bam HI Bam HI DNA Eco R I 750bp 8