【正文】 聚物加尾連接l人工接頭 人工接頭連接法BamHI接頭連接酶BamHI切割連接酶 +BamHI切割的pBR322（五）重組 DNA導(dǎo)入受體菌重組子導(dǎo)入受體菌的方式 ? ：u轉(zhuǎn)化（ transformation）： 特指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細菌的過程。u轉(zhuǎn)染（ transfection）： 病毒及其重組子導(dǎo)入受體細胞。導(dǎo)入方法u氯化鈣法感受態(tài) ?： 細菌處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)制備條件： 冰浴、低滲 CaCl2（ ）轉(zhuǎn)化反應(yīng)： 冰浴 30分 ?短暫 熱休克（ 42℃ ）轉(zhuǎn)化效率： 105106/181。gDNA。環(huán)狀 DNA高于線狀DNA1000倍u電穿孔法： 電穿孔儀（六）重組子的篩選與鑒定陽性菌落篩選：u抗藥性標(biāo)志： ampr、 tetr、 neoru插入抗性失活u互補篩選：藍白斑篩選（ α互補）、營養(yǎng)缺陷互補u分子雜交：原位雜交、 southern雜交插入外源性 DNA的鑒定：u酶切（目的片段長度）uPCRu測序表達蛋白的鑒定： 免疫學(xué)、生物學(xué)活性抗藥性篩選多克隆位點啟動子裂開的 N端裂開的 N端外源 DNA??半乳糖苷酶 N端編碼序列pUC182686bppUC182686bp染色體重組體 pUC18細菌在含 Xgal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng) 細菌在含 Xgal和乳糖操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC18含重組體 pUC18的白色菌落藍色菌落含載體 pUC18的藍色菌落??半乳糖苷酶C端編碼序列轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化利用 ?互補原理篩選（蘭白斑篩選）重組子 pUC18amprampr藍白斑篩選重組質(zhì)粒原位雜交Radioactive probe will hybridize with its plementary DNAWash filter, prepare autoradiograph and pare with master platePlace nitrocellulose filter in sealable plastic bag with solution of labeled DNA probeSouthernblot免疫學(xué)方法篩選重組子DNA 重組技術(shù)實例： 基因文庫構(gòu)建與篩選 人基因組文庫構(gòu)建ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophagelvector. 167。 人基因組 DNA用限制性內(nèi)切酶（ Sau3A）部分消化產(chǎn)生約 20kb帶粘性末端的部分重疊的隨機片段；167。載體消化： ?噬菌體 DNA用BamH1消化，去掉中間的可置換片段，并產(chǎn)生左右兩個帶粘性末端的片段167?；蚪M片段與 ?噬菌體 DNA拼接成重組 DNA167。 體外裝配有活性的噬菌體，并感染大腸桿菌167。 菌種培養(yǎng)、篩選、擴增保存InfectIndividualclonesProductionofoverlappingrestrictionfragmentsbypartialdigestionofhumangenomicDNAwithSau3A.Thisrestrictionendonucleaserecognizesthe4bpsequenceGATCandproducesfragmentswithsinglestrandedstickyendswiththissequenceonthe5’endofeachstrand.AhypotheticalregionofhumangenomicDNAshowingtheSau3Arecognitionsites(red)isshownatthetop.PartialdigestionofthisregionofDNAwouldyieldavarietyofoverlappingfragments(blue)≈20kblong.UseofsuchoverlappingfragmentsincreasestheprobabilitythatallsequencesinthegenomicDNAwillberepresentedina?library.Sau3AsitesHumanDNA~20kbpartialSau3AfragmentscDNA文庫構(gòu)建Preparationofabacteriophage?cDNAlibrary從文庫中篩選目的基因 外源基因在載體上表達必須具備： 強的啟動子 核糖體結(jié)合位點 翻譯起始和終止位點（七）克隆基因的表達原核表達體系 大腸桿菌、枯草桿菌表達系統(tǒng) 優(yōu)點： 方法簡單、迅速、經(jīng)濟，適合大規(guī) 模生產(chǎn)。 缺點： 但該系統(tǒng)缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，不宜表達真核基因組 DNA；缺乏翻譯后加工機制，如不能進行糖基化 修飾等；表達的蛋白質(zhì)通常形成包涵體。 酵母、昆蟲、哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 優(yōu)點： 能轉(zhuǎn)錄后加工，即能剪接內(nèi)含子； 能翻譯后加工，即能糖基化修飾等； 通常不形成包涵體，能正確折疊。 缺點： 但技術(shù)難度較大，成本較高，表達 量較低。真核表達體系第三節(jié) 重組 DNA與醫(yī)學(xué)的關(guān)系（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn) （二）生物制藥（三） DNA診斷 （四）基因治療（五）遺傳病的預(yù)防 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品 功 能組織胞漿素原激活劑 抗凝血液因子 VIII 促進凝血顆粒細胞 巨噬細胞集落剌激因子 剌激白細胞生成促紅細胞生成素 剌激白細胞生成生長因子 (bFGF,EGF) 刺激細胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (?1b,?2a,?2b,?) 抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素 激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶 抗組織損傷單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗 (CHO,酵母 ) 預(yù)防乙肝口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂重組 DNA技術(shù)實例 :轉(zhuǎn)基因小鼠（ transgenic mouse ）Photographshowingatransgenicmousewithanactiveratgrowthhormonegene(left).Thistransgenicmouseistwicethesizeofanormalmouse(right).1997年 2月 23日 英國 Roslin研究所 Wilmut 小組在英國《自然》雜志上發(fā)布用成年綿羊的乳腺上皮細胞（體細胞）核移植，獲得了一頭 多莉 克隆羊 姓名： Dolly　　性別：雌　　種族：哺乳綱，?？?，綿羊　　生日： 1996年 7月 5日　　出生地：蘇格蘭　　基因父親：無　　基因母親：一只 FinnDorset種白綿羊　　線粒體母親：一只蘇格蘭黑臉羊　　生育母親：另一只蘇格蘭黑臉羊　　進入社交圈時間： 1997年 2月 23日　　子女：生育 6名，存活 5名　　死亡： 2023年 2月 14日動物克隆動物克隆技術(shù)路線復(fù)習(xí)題概念： 重組 DNA技術(shù)（基因工程）、限制性核酸內(nèi)切酶、粘性末端、平末端、 cDNA文庫、基因組文庫、載體、多克隆位點、感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座、同源重組簡述題： DNA技術(shù)的基本過程及意義演講完畢，謝謝觀看！