基因工程11大腸桿菌基因工程-資料下載頁(yè)
2025-05-26 06:00本頁(yè)面
【正文】 素的結(jié)構(gòu)及其生物合成 S S S S C N S S B 肽（ 30） C 肽（ 31） A 肽（ 21） R R R K S S S S C N S S N C 高爾基體內(nèi)的特異性肽酶 N C 信號(hào)肽 B 肽 C 肽 A 肽 信號(hào)肽酶 人胰島素的生產(chǎn)方法 直接提取法制人胰島素 迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法： 早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足日益增多的糖尿病人的臨床需求。 人胰島素的生產(chǎn)方法 化學(xué)合成法制人胰島素 根據(jù)人胰島素 A鏈和 B鏈的序列，由單個(gè)氨基酸從頭合成。這條化學(xué)全合成的路線(xiàn)從技術(shù)上來(lái)說(shuō)是能夠做到的，但生產(chǎn)成本奇高，限制了廣泛應(yīng)用。 人胰島素的生產(chǎn)方法 化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素 豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在 B鏈的 C末端有一個(gè)氨基酸的差異，豬的為 Ala，人的為 Thr， 因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素不失為一種選擇。 技術(shù)路線(xiàn)是：在 pH為 67的有機(jī)相中使胰蛋白酶催化其逆反應(yīng)，該酶在過(guò)量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素 B鏈 C末端的丙氨酸交換下來(lái)，所形成的胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素。該過(guò)程的總轉(zhuǎn)化率為 60%。但工藝路線(xiàn)耗時(shí)，分離純化操作復(fù)雜，產(chǎn)品的價(jià)格不菲。 基因工程法制人胰島素 1982年，美國(guó) Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。 1987年， Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。 上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素 受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué) 等指標(biāo)上均與天然胰島素沒(méi)有任何區(qū)別，而且還具有無(wú)免疫原性、注射吸收迅速等 優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略： tac tac bGal bGal A peptide B peptide ori ori Apr Apr Met Met Met Met M M N C M M N C 化學(xué)合成 A鏈 和 B鏈的編碼 序列 表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線(xiàn)： M M N C M M N C bGal bGal A B CNBr 處理 N C S S S S C N S S N C N C N C N C Cys 體外氧化和重折疊 分離純化 A鏈和 B鏈分別表達(dá)法 生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)： 由于 A鏈和 B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低，通常只有 10% 20%，因此采用這條工藝路線(xiàn)生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá) 100美元 以上。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國(guó) Ely LiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線(xiàn)。 第二種基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略： tac bGal C peptide ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 人胰島素原 cDNA 重組人胰島素原 轉(zhuǎn)化 分離純化 表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線(xiàn)： S S S S C N 胰蛋白酶 C peptide A peptide B peptide M R R K R CNBr R S S S S C N N C S S S S R 羧肽酶 B B鏈中第 22位上的 Arg和第 29位上的 Lys由于良好折疊的原因，對(duì)胰蛋白酶不敏感 生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)： 在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于 C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)率也相應(yīng)提高，折疊率高達(dá) 80%以上。雖然這條工藝路線(xiàn)并不比 AB鏈分別表達(dá)法更為簡(jiǎn)捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元 。目前美國(guó) Ely LiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。 A鏈和 B鏈同時(shí)表達(dá)法 tac bGal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化學(xué)合成 AB鏈編碼序列 重組人胰島素 轉(zhuǎn)化 分離純化 CNBr 處理 特異性裂解 體外折疊 分泌型重組人胰島素表達(dá)法 上述路線(xiàn)均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶 基因拼接的方法，產(chǎn)生的融合蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。 一種分泌策略是將編碼序列與 b內(nèi)酰胺酶 基因拼接， b內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌具備穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的特性，為分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。
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