【正文】 P 堿性磷酸酶 5’ 3’ OH OH 3’ 5’ OH OH 多核苷酸激酶 5’ 3’ 32P OH 3’ 5’ OH 32P γ32PATP 返回 三、堿性磷酸酶與 DNA脫磷酸作用 ? 來(lái) 自 于 大 腸 桿 菌 （ bacterial alkaline phosphatase BAP ） 或 小 牛 腸 （ calf intestinal alkaline phosphatase CIP） ， 該酶用于脫去 DNA（ RNA） 5’末端的磷酸基團(tuán) ， 使 5’P成為 5’OH， 該過(guò)程稱(chēng)核酸分子的脫磷酸作用 。 當(dāng)需要 5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊?DNA片段自身連接 （ 或環(huán)化 ） 時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng) 。 ? BAP和 CIP的區(qū)別： ? CIP優(yōu)點(diǎn)：在 SDS中加熱到 68℃ 可以完全失活 ， 比活性比 BAP高 10～ 20倍 ? BAP：熱抗性酶 ， 終止作用需要酚 /氯仿反復(fù)抽提 返回 ? 核酸外切酶：一類(lèi)可以從多核苷酸的一端開(kāi)始按序催化降解核苷酸的酶 ， 可分為 單鏈的 核酸外切酶和 雙鏈的 核酸外切酶 。 第五節(jié) 核酸外切酶 ss DNA ds DNA 大腸桿菌外切酶 Ⅰ （ exo Ⅰ ） 大腸桿菌外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ） 大腸桿菌外切酶 Ⅶ （ exo Ⅶ ） λ噬菌體核酸外切酶（ λexo） T7噬菌體基因 6核酸外切酶 一般特點(diǎn)： 來(lái)自于 ，分子量 28,000 kD 催化反應(yīng)類(lèi)型 （ 1） 外切酶活性： 3’→ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 dsDNA， pH （一）外切酶 III（ Exo III） —— ds DNA 539。P 539。P 339。HO 339。HO OH339。 OH 339。 P 539。 P 539。 539。P 339。HO 339。HO P539。 ? 外切酶活性特點(diǎn) ① 反應(yīng)底物：互補(bǔ) dsDNA ② 堿基釋放速度： CA～ TG ③ 反應(yīng)產(chǎn)物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的 dsDNA， 過(guò)渡反應(yīng)將導(dǎo)致 DNA降解 （ 2） 核酸酶 H活性：除去 DNARNA雜交分子中的RNA分子 ， pH （ 3） 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端 ， 有利于 DNA聚合酶反應(yīng) ， pH （ 4） 內(nèi)切酶活性：在無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶處將 DNA鍵切開(kāi) ， pH 339。HO P539。 P539。 339。HO RNase H 用途 （ 1） 核酸（ DNA）標(biāo)記 配合使用 klenow酶 ExoIII ExoIII [α 32P] [α 32P] dCTP dCTP 539。P P539。 539。P P539。 339。HO OH339。 339。HO OH339。 Exo III用于 DNA標(biāo)記 （ 2）基因突變 缺失 （ 3） DNA序列測(cè)定時(shí)作順序缺失 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b c ExoIII用于順序缺失 ExoIII優(yōu)先降解 3’端隱蔽的末端 exoⅦ 降解 5’突出端 SⅠ 使用注意事項(xiàng) ? 正式使用前 ， 測(cè)定在一定條件下酶的反應(yīng)速度 ? 在一定條件下 ， ExoIII不能作用 GC富集區(qū)（ 來(lái)自于 cDNA加尾 ） （二） λ噬菌體核酸外切酶（ λexo） T7噬菌體基因 6核酸外切酶 —— ds DNA λexo （ 1） 來(lái)源：從感染了 λ噬菌體的大腸桿菌中純化而來(lái) （ 2） 特點(diǎn)：催化雙鏈 DNA自 5’P末端進(jìn)行逐步的加工水解 ， 釋放出 5’單核苷酸 ， 但不降解 5’OH 539。P 539。P 339。HO 339。HO OH339。 OH 339。 P 539。 P 539。 （ 3） 用途 ? 將雙鏈變?yōu)閱捂?， 供雙脫氧測(cè)序分析 ? 從 DNA中移去 5’突出端 ， 以便用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行加尾 T7噬菌體基因 6核酸外切酶 （ 1） 來(lái)源 大腸桿菌 T7噬菌體基因 6編碼的產(chǎn)物 （ 2） 特點(diǎn) ? 自 5’OH和 5’P末端移去核苷酸 ， 其活性比λ exo低 ， 主要用于從 5’端開(kāi)始的有控制的勻速降解 。 三、大腸桿菌外切酶 Ⅶ （ exoⅦ ） —— ss DNA （ 1） 特點(diǎn)： ? 單鏈核酸外切酶 ， 從 5’末端和 3’末端降解DNA， 產(chǎn)生寡核苷酸片段 ， 反應(yīng)不要 Mg2＋ 5’ 3’ 3’ 5’ exoⅦ 5’ 3’ 3’ 5’ 第六節(jié) 單鏈核酸內(nèi)切酶 來(lái)源 ? 真菌 Aspergillus oryzae（ 稻谷曲霉 ） 特點(diǎn) ? ， 低水平Zn2+ （ 1） 可以降解單鏈 DNA和 RNA 一、 S1核酸酶 （ 2）作用于雙鏈分子的單鏈區(qū)，并從此切割核酸分子 RNA分子定位 3’ 5’ DNA RNA AAAAA 400 1400 A S1核酸酶 堿變性，電泳檢測(cè)大小 Endo RX B C 3’ 5’ DNA RNA 1000bp S1核酸酶 3’ DNA RNA 3’ 5’ DNA RNA AAAAA 二、 Bal31核酸酶 來(lái)源 埃氏交替單胞菌中分離而來(lái) 特點(diǎn) ? 單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性和雙鏈特異的核酸外切酶活性 ? 需要 Ca2＋ 和 Mg2＋ ， EGTA可終止反應(yīng) （ 1） 雙鏈環(huán)型 DNA：?jiǎn)捂溙禺惖暮怂醿?nèi)切酶活性通過(guò)單鏈切口或瞬時(shí)單鏈區(qū)的降解作用將超螺旋結(jié)構(gòu)降解為線性 DNA （ 2） 線性雙鏈 DNA： 雙鏈特異的核酸外切酶 會(huì)從兩端去除核苷酸 ， 能夠有效的控制降解速度 。 Ca2＋ （ 3）單鏈 DNA或者 RNA（單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性） 5’ 3’ Ca2＋ dNMP或 rNMP （ 4） 內(nèi)切酶活性 ， 即從內(nèi)部切割 DNA的單鏈區(qū) ， 3’外切酶活性大約為它的單鏈特異性?xún)?nèi)切酶活性的 20倍 Ca2＋ 用途 ① 用于不同長(zhǎng)度的刪除突變克隆實(shí)驗(yàn)及基因結(jié)構(gòu) 、 機(jī)能分析 —— 控制消化法 A EcoRⅠ EcoRⅠ 酶切 A Bal 31降解 加銜接物環(huán)化 形成缺失的質(zhì)粒分子 ② 繪制 DNA限性?xún)?nèi)切圖譜 ? Bal 31降解 DNA絕對(duì)依賴(lài)于 鈣 離子的存在 。因此可以在反應(yīng)的不同階段加入螯合劑EGTA而使反應(yīng)終止 。 限制性酶切 ， 考察酶切譜帶的消失順序 ， 判斷酶切位點(diǎn)的位置 ? 由于 Bal 31從末端降解 DNA的作用相對(duì)比較均勻 ， 因此 Bal 31可用于確定 DNA小片段的限制酶切圖 。 ? 練習(xí)：已知一個(gè)原核生物基因的兩端序列 ， 請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中大量擴(kuò)增這個(gè)基因 。 5’端為 GCTCCATGACCCAGGCA 3’端為 CGATCTTTTGAGTCCATG 5’ GCTCCATGACCCAGGCA———— GATCTTTTGAGTCCATG 3’ PCR（ Taq） 上游引物： 5’ GCTCCATGACCCAGGCA 3’ 下游引物： 3’ CTAGAAAACTCAGGTAC 5’ A A T vector T4 ligase 5’ GCTCCATGACCCAGGCA———— GATCTTTTGAGTCCATG 3’ 上游引物： 5’ GGAATTCGCTCCATGACCCAGGCA 3’ 下游引物： 3’ CTAGAAAACTCAGGTACAGATCTGC 5’ EcoRI BglII PCR擴(kuò)增 GGAATTC CCTTAAG TCTAGACG AGATCTGC EcoRⅠ ＋ BglⅡ AATTC G A TCTAG EcoRⅠ ＋ BglⅡ EcoRⅠ 堿性磷酸酶 OH OH T4 ligase T4 ligase