分子克隆工具酶(2)-資料下載頁
2025-05-26 03:44本頁面
【正文】 ③ 活化的 5’ 磷酸根與相鄰的 3′羥基形成 3’,5’磷酸二酯鍵 ， 并釋放出 AMP。 修復(fù)雙鏈 DNA缺口處的磷酸二酯鍵 修復(fù)與 RNA結(jié)合的 DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵 ? 連接多個平頭雙鏈 DNA分子： DNA連接酶的反應(yīng)條件 TrisHCl 50100mmol/L MgCl2 10mmol/L ATP DTT 5mmol/L Volume 1020μL Temperature 425℃ (16℃ optimal) Time 416h 平頭雙鏈 DNA片段的連接操作 從分子動力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢的多。 提高平頭末端連接效率的方法包括： ? 加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接）。 ? 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會。 ? 加入 10% PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用。 ? 加入單價陽離子（ NaCl） ,最終濃度 150200 mmol/L。 三、 T4多核苷酸磷酸激酶（ T4PNP） 四、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 53 五、核酸酶（ Nuclease） BAL 31核酸酶 來源于交替單胞菌，從線性 DNA兩條鏈的 3’末端迅速去除單核苷酸，隨后從單鏈內(nèi)部發(fā)揮緩慢的內(nèi)切酶活性，形成截短的平末端雙鏈 DNA及以帶有 5個核苷酸突出單鏈的截短分子。 用來從兩頭縮短 DNA，用于構(gòu)建嵌套缺失體。 ? S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌 ? 降解單鏈 DNA速度比降解雙鏈 DNA快 75000倍 ? Zn2+必需 ? 最適 pH范圍為 ? 需要 NaCl 10300mmol/L ? 降解單鏈 DNA的速度比降解單鏈 RNA快 7倍 ? 用于分析 DNA:RNA雜交體的結(jié)構(gòu)，去掉雙鏈核酸中突出的單鏈尾從而產(chǎn)生平末端，打開雙鏈 cDNA合成產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。 3. 綠豆核酸酶（ mung bean nuclease） 類似于 S1酶，但比 S1酶更溫和。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 57 核糖核酸酶 A（ ribonulease A或 RNase A） ? 為內(nèi)切核酸酶，可特異性攻擊 RNA上嘧啶殘基的 3’端，不需要 Mg2+，用于 DNA中 RNA的去除，使用前高溫加熱以去除 DNase。 ? 可在高溫下活性，不易滅活。 脫氧 核糖核酸酶（ DNaseⅠ ） ? 為內(nèi)切核酸酶，優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA，需要 Mg2+，用于去除 RNA中的 DNA、切口平移法探針標(biāo)記等。 ? 適溫為 37℃ 。 外切酶核酸 Ⅲ 催化雙鏈 DNA的 3’羥基端逐一去除單核苷酸的反應(yīng)，用途廣泛，如 DNA截短、探針合成等。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 59 核糖核酸酶 H（ RNase H） 是內(nèi)切核酸酶，特異性水解與 DNA雜交的 RNA鏈，不降解單核酸、雙鏈 DNA和雙鏈 RNA，用于 cDNA第二鏈合成之前去除與 cDNA第一鏈結(jié)合的原模板 mRNA。 RNase One 為 Promega公司開發(fā)，可降解 RNA至小片段甚至單核苷酸，是唯一可在所有 4種堿基處切割磷酸二酯鏈的酶。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程 60 六、核酸酶抑制劑（ RNase inhibitor） 一些重要的公司均有開發(fā)，可特異結(jié)合并抑制 RNase，用于 RNA反轉(zhuǎn)錄過程中作為 RNA的保護(hù)劑。 七、瓊脂糖酶（ agarase） 可將瓊脂亞單位水解為新瓊脂寡糖，用于從低熔點(diǎn)瓊脂糖中分離純化大片段 DNA或 RNA分子。 八、 DNA結(jié)合蛋白 單鏈 DNA結(jié)合蛋白（ single strand binding protein, SSB）：削弱鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，用于 DNA電鏡觀察、增加 DNA長鏈的合成能力等。 RecA蛋白：可與單鏈 DNA結(jié)合，還可促進(jìn)雙鏈 DNA對同源單鏈 DNA的吸收作用，是一個依賴于 DNA的 ATP酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅰ （ topoisomeraseⅠ ）：瞬時破壞并再生磷酸二酯鏈，解除共價閉環(huán) dsDNA的超螺旋。 本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容 ? 限制性核酸內(nèi)切酶的定義、命名、類型和末端屬性。 ? 限制酶的主要性質(zhì)、影響酶活性的因素、星活力原因。 ? 甲基化和甲基化酶的基本特征和在實(shí)踐的指導(dǎo)作用。 ? 反轉(zhuǎn)錄酶的特點(diǎn)和主要用途。 ? Klenow酶和 T4 DNA聚合酶的性質(zhì)及用途。 ? Taq DNA聚合酶的基本特征和用途。 ? T4 DNA連接酶的用途和作用機(jī)制。 ? 其它工具酶的基本功能及其用途。
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