【正文】 。 如質(zhì)粒 pBR322用氨芐青霉素抗性基因 （ Ampr） 和四環(huán)素抗性基因 （ Tetr） 作篩選標(biāo)記 ， 受體細胞則用對 Amp和 Tet敏感的大腸桿菌 HB101細胞 。 將外源 DNA導(dǎo)入靶細胞的方法很多 ， 應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康?、 受體細胞種類 、 外源基因大小等不同來選擇 。 導(dǎo)入方法大致分為三類 ⑴ 化學(xué)方法： 如 CaCl2轉(zhuǎn)化法 、 磷酸鈣共沉淀法 。 在磷酸鈣 DNA共沉淀方法中將被轉(zhuǎn)化的 DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后 ， 通過內(nèi)吞作用進入受體細胞 。 另外還有 DEAE─ 葡聚糖轉(zhuǎn)化法等 。 ⑵ 物理方法： 如電脈沖介導(dǎo)法 、 顯微注射法 、 基因發(fā)射槍一類的顆粒轟擊技術(shù)等 。 在轉(zhuǎn)基因動物實驗中 ， 對體積較大的受精卵細胞或胚胎干細胞 ， 可將目的基因重組體通過微吸管直接注射入細胞核 ， 即顯微注射法 ， 此法需要精密儀器及高超技術(shù) 。 ⑶ 生物方法： 包括原生質(zhì)融合法 、 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 ， 以及 λ 噬菌體的體外包裝感染法和逆轉(zhuǎn)錄病毒和 DNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法 。 其中重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和重組 DNA病毒 （ 如腺病毒 ） 轉(zhuǎn)染受體細胞目前常應(yīng)用于遺傳疾病或腫瘤的基因治療中 。 基因片段 （ 特別是純化的 DNA）很難直接導(dǎo)入受體細胞 ， 通常將受體細胞預(yù)先加以處理 ， 使其提高基因?qū)爰毎男?。 例如用低溫 CaCl2（ 冰浴 ） 處理大腸桿菌 ，可以大大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率 。這種經(jīng)過預(yù)處理的 、 容易導(dǎo)入外源核酸分子的受體細胞被稱作“ 感 受 態(tài) 細 胞 ” （ petent cell） 。 感受態(tài)細胞 Ca2+誘導(dǎo)的完整細胞的轉(zhuǎn)化（大腸桿菌，革蘭氏陽性）1970年建立了此技術(shù)，其原理是與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，并發(fā)生收縮作用，使細胞出現(xiàn)空隙，細菌這時的狀態(tài)就是感受態(tài)。 六、陽性克隆的篩選與鑒定 ? 通過轉(zhuǎn)化 、 感染 、 轉(zhuǎn)染等方式 ， 重組體 DNA分子被導(dǎo)入受體細胞 ， 經(jīng)適當(dāng)涂布的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到大量 轉(zhuǎn)化子菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑 。 ? 因為每一重組體只攜帶某一段外源基因 ， 而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時每一受體菌又只能接受一個重組體分子 ， 所以設(shè)法將眾多的轉(zhuǎn)化菌落或噬菌斑區(qū)分開來 ， 并 鑒定哪一菌落或噬菌斑所含的重組 DNA分子確實帶有目的基因 ， 即可得到目的基因的克隆 ， 這一過程即為 篩選 （ screening） 。 ? 根據(jù)載體體系 、 宿主細胞特性及外源基因在受體細胞表達情況不同 ， 可采取不同的篩選方法 。 遺傳表型改變篩選法 ? 如果克隆載體攜帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，如 Ampr或 Tetr，轉(zhuǎn)化后只有 含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌 才能在含 該抗生素的培養(yǎng)板 上生存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。 ? 如果重組 DNA時將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，如插入 Tetr內(nèi)，使標(biāo)志基因 Tetr失活，陽性重組子則不能在含有 Tet的培養(yǎng)板上生長。用 插入失活 篩選的重組子載體往往帶有另一個抗生素抗性基因如 Ampr，因此可以通過 雙抗生素對照篩選 ，即陽性轉(zhuǎn)化子可以在含 Amp的培養(yǎng)板上生長而不能在含 Tet的培養(yǎng)板上生長。 ? 顯色反應(yīng) 藍白斑實驗 ? 當(dāng)然，非目的基因插入的載體或自身環(huán)化的載體導(dǎo)入的受體菌也能在含抗生素的培養(yǎng)板上生長，造成 假陽性克隆 ，因此抗菌標(biāo)志篩選只能是初篩（噬菌體載體轉(zhuǎn)化菌形成的噬菌斑也可以進行初篩），還需要進一步確定重組體是否含有目的基因。 雙抗生素對照篩選 電泳篩選法 ? 直接提取重組 DNA進行核酸凝膠電泳。DNA的電泳遷移率與其分子量的大小成反比。因此那些帶有外源 DNA的重組體分子量大于空載體 DNA，在凝膠中 “ 跑得慢 ” 。 ? 另外用不同的限制性內(nèi)切酶切割重組DNA，分析 酶切圖譜 ，也可進一步驗證陽性克隆。 分子雜交法篩選 ? 核酸分子雜交廣泛應(yīng)用于 鑒別陽性重組體 、篩選基因 、 確定 DNA同源性 、 研究基因定位等 ，是現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程中最基本 、 最重要的技術(shù)之一 。 ? 主要方式是將待雜交的核酸分子固定在適當(dāng)?shù)闹С治锷?， 用放射性標(biāo)記或生物素等非放射性標(biāo)記的 探針 與 被固定的分子雜交 ， 以檢測目的 DNA或 RNA分子存在與否及其位置等 。 將轉(zhuǎn)化后得到的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜（ nitrocellulose filter membrane， NC膜）上，得到一個與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復(fù)制品。 原位裂解細胞，堿變性，核酸分子被固定于膜上。 然后加入標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進行雜交。凡是含有與探針互補序列的菌落或噬菌斑經(jīng)放射自顯影或顯色底物處理后，就會在X光底片上出現(xiàn)雜交點或在 NC膜上顯色。 根據(jù)陽性反應(yīng)位置，可從保留的母板上挑出所需的克隆 菌落（噬菌斑）原位雜交 （ In situ hybridization） 硝酸纖維 薄膜 與探針 雜交 薄膜 放射 自顯影 膠片 選擇所 需克隆 Southern雜交 （ Southern blot） 由 Southern于 1975年發(fā)明，故命名?？捎糜谶M一步驗證目的 DNA片段是否插入載體或整合于細胞染色體中。 基本程序是提取重組 DNA或基因組 DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化后，用凝膠電泳將 DNA片段按其大小分開 。 堿變性后轉(zhuǎn)移到 NC膜上，然后與標(biāo)記的DNA或 RNA探針進行雜交。 同樣，凡是含有與探針互補序列的 DNA片段經(jīng)放射自顯影或顯色底物處理后，就會在 X光底片上出現(xiàn)雜交帶或在膜上顯色 斑點雜交（ Dot blot）與 Southern雜交的不同之處只在于被檢測的 DNA不經(jīng)電泳分離，直接點在 NC膜上用于雜交分析。 免疫學(xué)篩選方法 免疫學(xué)篩選是利用特異抗體與目的基因表達的抗原產(chǎn)物相互作用進行篩選，特異性和敏感性也較高，尤其適用于篩選不為宿主菌提供任何選擇標(biāo)記的基因，或者是已獲得了該基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多克隆或單克隆抗體，用這些抗體來檢測目的基因表達的產(chǎn)物。 ? 免疫學(xué)方法很多，如 Western blot，還有 免疫化學(xué)方法 、 酶聯(lián)免疫吸附劑測定 （ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）、 放射免疫沉淀 、 免疫熒光抗體技術(shù) 等，可對目的基因表達的蛋白進行定性，甚至定量檢測。 Western blot的被測物是目的基因所表達的蛋白質(zhì)。經(jīng) SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳后的樣品轉(zhuǎn)移到 NC膜上，將印有蛋白條帶的 NC膜依次與目的蛋白的特異抗體、酶標(biāo)記或同位素標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，然后用底物顯色或放射自顯影來檢測蛋白區(qū)帶的信號。 Western blot檢測蛋白質(zhì)特異性和敏感性高，可檢測出 ng水平的蛋白質(zhì)。 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR）篩選 外源基因插入載體后 ， 可根據(jù)外源基因兩側(cè)載體序列或直接利用目的基因 539。 端和 339。 端序列設(shè)計引物 ， 以提取的重組 DNA為模板進行 PCR擴增 ， 看是否能擴出目的基因片段 ， 進而篩選陽性克隆 。 DNA序列測定 DNA序列測定是驗證插入載體中的外源基因是否正確的 最確鑿證據(jù) ， 也是篩選的最后一步 ， 往往在基本確定陽性克隆后再測序 。 目前 ， DNA測序已高度自動化 ， 所依賴的基本技術(shù)原理一是 Allan Maxam和 Walter Gilbert創(chuàng)建的化學(xué)裂解法 ， 二為 Frederick Sanger建立的雙脫氧末端終止法 。 基因克隆的基本步驟 粘性末端 質(zhì)粒 目的基因 粘性末端 匹配的粘性末端 酶切后的目的基因片段 接 (連接 ) 連接后的重組質(zhì)粒 DNA分子 重組質(zhì)粒 目的基因 大腸桿菌 轉(zhuǎn) (轉(zhuǎn)化 ) 染色體 真好玩 ! 篩 (篩選 ) 分解抗生素的酶 含抗生素的培養(yǎng)基 還活著 ! 玩完啦 ! 大腸桿菌 大腸桿菌 大量生長 提取大量 質(zhì)粒 酶切鑒定 您已經(jīng)掌握基因克隆的主要步 ！ ? 分 離目的基因和載體DNA。 ? 用合適的酶 切 割上述兩者，產(chǎn)生匹配的末端。 ? 連 接 酶將目的基因裝入載體。 ? 轉(zhuǎn) 入細菌。 ? 篩 選具有抗藥性克隆。