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2025-01-05 09:17本頁(yè)面
【正文】 isHCl , 2550mM； 10mM MgCl2 ； NaCl 0150mM； DTT 1mM 根據(jù)不同酶對(duì)鹽離子要求不同，可將緩沖液分為以下三種情況： 高鹽： 100150mM 中鹽： 50100mM 低鹽： 050mM 二、酶切操作 DNA量的確定，加入酶量的確定，反應(yīng)體積的確定（ 20μl），反應(yīng)時(shí)間的確定，一般為 37℃ ，但也有例外，如Taq I在 65176。 C時(shí)活性最高。 單位限制性?xún)?nèi)切酶定義為： 在最佳緩沖系統(tǒng)和 20μl體積中反應(yīng) 1小時(shí)，完全水解1μgDNA所需的酶量 。 三、酶切結(jié)果分析 （一） 酶切片段的檢測(cè) 1） 通過(guò)凝膠電泳分離，根據(jù)分子量分離。根據(jù)凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離 1300bp的分子。 2） DNA分子的檢測(cè) a. 染色 EB， DNA分子小于 25ng，很難檢測(cè)到。 b. 放射性自顯影 , 可以監(jiān)測(cè)少到 2ng DNA分子。 （二）估計(jì) DNA分子的大小 根據(jù) DNA分子的遷移率，可以用公式計(jì)算出分子量 D= a – b (logM) D是移動(dòng)的距離， M是分子量， a, b是恒量但隨著電泳條件的改變而改變。 也可根據(jù)已知大小的片段進(jìn)行比較，誤差約在 5%左右。 四、多酶聯(lián)合酶解 對(duì)于對(duì)濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶解； 五、定位酶切位點(diǎn) ?建立酶切圖譜需要的酶類(lèi) ?確定每一種酶酶切后產(chǎn)生的分子量和片段數(shù)目 ?進(jìn)行雙酶切 ?比較酶切和雙酶切的結(jié)果，繪制酶切圖譜 ?含糊的位點(diǎn)可以通過(guò)部分酶切解決（可短時(shí)間的酶切或者在 4℃ 條件下進(jìn)行） 六、 限制性?xún)?nèi)切酶的 star活性 在 pH不合適，或甘油濃度過(guò)高 ≥10%時(shí)，限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)非專(zhuān)一性，因此應(yīng)確保酶的體積為總體積的十分之一以下。
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