分子克隆工具酶(2)(編輯修改稿)
2025-06-22 03:44 本頁面
【文章內容簡介】 大于 100 U/μg DNA。 ③ 低離子強度 ， 小于 25 mmol/L。 ④ 高 pH， 大于 。 ⑤ 含有機劑如乙醇 、 二甲基亞砜 、 二甲基乙酰胺等 。 ⑥ Mn2+、 Cu2+、 Co2+、 Zn2+等非 Mg2+的二價離子的存在 。 ? 易發(fā)生星活性的內切酶有： EcoRI、 HindⅢ 、 KpnI、 PstI、SalI、 HinfI等。 ? 辦法：對因改進。 八 、 單鏈 DNA的切割 ? 多數(shù)限制酶很難切割單 DNA模板 。 ? 部分限制酶除切割雙鏈 DNA外 ， 還可切割單 DNA， 但活性一般都不高 。 ? 切口酶雖然識別雙鏈 ， 但只在單鏈上切口 ， 名稱前要加一個N。 九 、 酶切位點的引入 現(xiàn)代基因工程中通過引物化學合成等方式可以很方便進向目標位置引入設計的酶切位點 。 通過不同酶切末端的連接重組也可產生新的酶切位點 ， 對具體情況的分析在設計中有價值： 5’ 突出末端補平后重連； 同尾末端連接； 平末端連接 。 十、影響限制性核酸內切酶活性的因素 ① DNA樣品的純度 DNA樣中混有蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、 NaCl等都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： ? 加大酶的用量， 1μg DNA用 10U酶 ? 加大反應總體積 ? 延長反應時間 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 21 ② DNA樣品的甲基化程度 ? 大腸桿菌中的 dam甲基化酶在 5′GATC3′序列中的腺嘌呤 N6位引入甲基，受其影響的酶有 BclI、 Mbol等，但 BamHI、 BglII、Sau3AI不受影響。 ? 大腸桿菌中的 dcm甲基化酶在 5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基，受其影響的酶有 EcoRII等，但 BglI、KpnI不受影響。 ? 采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來制備質粒 DNA，可防止DNA的甲基化。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 22 十一、基因組中酶切位點分布的不均一性 在基因組中酶切位點的分布并不是均一的。 大腸桿菌中六堿基識別的酶 SpeⅠ 平均 60kb才出現(xiàn) 1次。 酵母中重復序列以外富含 GC的識別序列較少。 哺乳動物基因組中 CG序列只有隨機概率值的 1/5，且多數(shù)發(fā)生胞嘧啶甲基化， SmaⅠ 位平均約 65kb才出現(xiàn) 1次。 果蠅和線蟲中 CG基序雖然少，但不發(fā)生甲基化。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 23 限制性核酸內切酶操作的注意事項 ① 商品化的限制性核酸內切酶均為濃縮液 ， 每次操作時應使用新的吸頭去取酶 ， 加入酶的體積應不超過總體積的 10%，否則酶液中的甘油濃度超過 5%時將會抑制酶的活性 。 ② 整個操作應在 0℃ 進行 ， 即在冰浴中進行 ， 而且是在加入其它試劑之后 ， 最后加入酶 。 ③ 當切割大量 DNA時 ， 通常采用延長反應時間 ， 減少酶的用量 。 ④ 當 DNA需 2種或以上酶切時，應用通用緩沖液，若沒有通用緩沖液時，只有用 1種酶切完后，純化酶切產物，再進行下一個酶切反應 。 ⑤ 正確保存、分裝和取用限制酶，抽提高質量的 DNA。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 24 Ⅱ 限制性核酸內切酶的主要用途 ① 在特異位點上切割 DNA， 產生特異的限制性酶片段 。 ② 建立 DNA分子的限制酶圖譜 。 ③ 構建基因文庫 。 ④ 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。 ⑤ 改建質粒。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 25 第二節(jié) 甲基化酶 一、甲基化酶的種類 原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（ methylase），又稱甲基轉移酶（ methyltransferase），大腸桿菌中有 3種。 Dam甲基化酶 可在 GATC序列中的腺嘌呤的 N6位置上引入甲基。一般哺乳動物DNA不會發(fā)生腺嘌呤的 N6甲基化。 一些酶對 Dam甲基化敏感 ，如 BclⅠ 、 ClaⅠ 、 XbaⅠ 等。 一些酶 對 Dam甲基化不敏感 ，如 BamHⅠ 、 SaU3AⅠ 、 BglⅡ 、PvuⅠ 等。 Dcm甲基化酶 識別 CCAGG或 CCTGG序列，在第二個胞嘧啶 C的 C5位置引入甲基。 一些酶對 Dcm甲基化敏感 ，如 Acc65Ⅰ 、 ApaⅠ 、 EaeⅠ 等。 一些酶 對 Dcm甲基化不敏感 ，如 BanⅠ 、 BglⅠ 、 KpnⅠ 等。 2022/6/23 西南大學生物技術專業(yè) 基因工程 26 EcoKⅠ 甲基化酶 研究較少。 SssⅠ 甲基化酶 來自螺旋體，可使 CG序列中的 C在 C5位置上發(fā)生甲基化 敏感的酶有： ClaⅠ 、 XhoⅠ 、 SalⅠ 等。 不敏感的酶有： BamHⅠ 、 EcoRⅠ 、 SphⅠ 、 KpnⅠ 等 二、依賴于甲基化的限制系統(tǒng) 大腸桿菌中至少有 3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)： McrA
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