分子克隆工具酶(2)(編輯修改稿)
2025-06-22 03:44 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 大于 100 U/μg DNA。 ③ 低離子強(qiáng)度 ， 小于 25 mmol/L。 ④ 高 pH， 大于 。 ⑤ 含有機(jī)劑如乙醇 、 二甲基亞砜 、 二甲基乙酰胺等 。 ⑥ Mn2+、 Cu2+、 Co2+、 Zn2+等非 Mg2+的二價(jià)離子的存在 。 ? 易發(fā)生星活性的內(nèi)切酶有： EcoRI、 HindⅢ 、 KpnI、 PstI、SalI、 HinfI等。 ? 辦法：對(duì)因改進(jìn)。 八 、 單鏈 DNA的切割 ? 多數(shù)限制酶很難切割單 DNA模板 。 ? 部分限制酶除切割雙鏈 DNA外 ， 還可切割單 DNA， 但活性一般都不高 。 ? 切口酶雖然識(shí)別雙鏈 ， 但只在單鏈上切口 ， 名稱(chēng)前要加一個(gè)N。 九 、 酶切位點(diǎn)的引入 現(xiàn)代基因工程中通過(guò)引物化學(xué)合成等方式可以很方便進(jìn)向目標(biāo)位置引入設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn) 。 通過(guò)不同酶切末端的連接重組也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) ， 對(duì)具體情況的分析在設(shè)計(jì)中有價(jià)值： 5’ 突出末端補(bǔ)平后重連； 同尾末端連接； 平末端連接 。 十、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 ① DNA樣品的純度 DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、 NaCl等都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： ? 加大酶的用量， 1μg DNA用 10U酶 ? 加大反應(yīng)總體積 ? 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 基因工程 21 ② DNA樣品的甲基化程度 ? 大腸桿菌中的 dam甲基化酶在 5′GATC3′序列中的腺嘌呤 N6位引入甲基，受其影響的酶有 BclI、 Mbol等，但 BamHI、 BglII、Sau3AI不受影響。 ? 大腸桿菌中的 dcm甲基化酶在 5′CCAGG3′或 5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基，受其影響的酶有 EcoRII等，但 BglI、KpnI不受影響。 ? 采用去甲基化酶的大腸桿菌菌株來(lái)制備質(zhì)粒 DNA，可防止DNA的甲基化。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 基因工程 22 十一、基因組中酶切位點(diǎn)分布的不均一性 在基因組中酶切位點(diǎn)的分布并不是均一的。 大腸桿菌中六堿基識(shí)別的酶 SpeⅠ 平均 60kb才出現(xiàn) 1次。 酵母中重復(fù)序列以外富含 GC的識(shí)別序列較少。 哺乳動(dòng)物基因組中 CG序列只有隨機(jī)概率值的 1/5，且多數(shù)發(fā)生胞嘧啶甲基化， SmaⅠ 位平均約 65kb才出現(xiàn) 1次。 果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中 CG基序雖然少，但不發(fā)生甲基化。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 基因工程 23 限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng) ① 商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液 ， 每次操作時(shí)應(yīng)使用新的吸頭去取酶 ， 加入酶的體積應(yīng)不超過(guò)總體積的 10%，否則酶液中的甘油濃度超過(guò) 5%時(shí)將會(huì)抑制酶的活性 。 ② 整個(gè)操作應(yīng)在 0℃ 進(jìn)行 ， 即在冰浴中進(jìn)行 ， 而且是在加入其它試劑之后 ， 最后加入酶 。 ③ 當(dāng)切割大量 DNA時(shí) ， 通常采用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 ， 減少酶的用量 。 ④ 當(dāng) DNA需 2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液，若沒(méi)有通用緩沖液時(shí)，只有用 1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng) 。 ⑤ 正確保存、分裝和取用限制酶，抽提高質(zhì)量的 DNA。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 基因工程 24 Ⅱ 限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途 ① 在特異位點(diǎn)上切割 DNA， 產(chǎn)生特異的限制性酶片段 。 ② 建立 DNA分子的限制酶圖譜 。 ③ 構(gòu)建基因文庫(kù) 。 ④ 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。 ⑤ 改建質(zhì)粒。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 基因工程 25 第二節(jié) 甲基化酶 一、甲基化酶的種類(lèi) 原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶（ methylase），又稱(chēng)甲基轉(zhuǎn)移酶（ methyltransferase），大腸桿菌中有 3種。 Dam甲基化酶 可在 GATC序列中的腺嘌呤的 N6位置上引入甲基。一般哺乳動(dòng)物DNA不會(huì)發(fā)生腺嘌呤的 N6甲基化。 一些酶對(duì) Dam甲基化敏感 ，如 BclⅠ 、 ClaⅠ 、 XbaⅠ 等。 一些酶 對(duì) Dam甲基化不敏感 ，如 BamHⅠ 、 SaU3AⅠ 、 BglⅡ 、PvuⅠ 等。 Dcm甲基化酶 識(shí)別 CCAGG或 CCTGG序列，在第二個(gè)胞嘧啶 C的 C5位置引入甲基。 一些酶對(duì) Dcm甲基化敏感 ，如 Acc65Ⅰ 、 ApaⅠ 、 EaeⅠ 等。 一些酶 對(duì) Dcm甲基化不敏感 ，如 BanⅠ 、 BglⅠ 、 KpnⅠ 等。 2022/6/23 西南大學(xué)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè) 基因工程 26 EcoKⅠ 甲基化酶 研究較少。 SssⅠ 甲基化酶 來(lái)自螺旋體，可使 CG序列中的 C在 C5位置上發(fā)生甲基化 敏感的酶有： ClaⅠ 、 XhoⅠ 、 SalⅠ 等。 不敏感的酶有： BamHⅠ 、 EcoRⅠ 、 SphⅠ 、 KpnⅠ 等 二、依賴(lài)于甲基化的限制系統(tǒng) 大腸桿菌中至少有 3種依賴(lài)于甲基化的限制系統(tǒng)： McrA
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