【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 掉，某些類(lèi)型的儀器也有采用捕獲管來(lái)進(jìn)行分選的。 　　穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百μm。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間，一般為數(shù)十ms。精確測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來(lái)產(chǎn)生延遲?？筛鶕?jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。 　?。?0）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對(duì)儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問(wèn)題而定。 　　①數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖、二維點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。 　　直方圖是一維數(shù)據(jù)用作最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線(xiàn)。根據(jù)選擇放大器類(lèi)型不同，橫座標(biāo)可以是線(xiàn)性標(biāo)度或?qū)?shù)標(biāo)度，用“道數(shù)”來(lái)表示,實(shí)質(zhì)上是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度?？v座標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。圖102給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。 　　二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。橫座標(biāo)和縱座標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)座標(biāo)植的細(xì)胞存在（圖103）。可以由二維點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說(shuō)多個(gè)細(xì)胞具有相同的二維座標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個(gè)點(diǎn)，這樣對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。 圖102　直方圖 圖103　二維點(diǎn)圖 　　二維等高圖類(lèi)似于地圖上的等高線(xiàn)表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線(xiàn)上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線(xiàn)層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線(xiàn)越密集則表示變化率越大，等高線(xiàn)越疏則表示變化平衡。圖104給出了二維等高圖的樣式。 　　假三維圖是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)二維等高圖的一種視覺(jué)直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱座標(biāo)—細(xì)胞數(shù)同時(shí)顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)　，這無(wú)疑是有助于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的。圖105為假三維圖的示意圖。 圖104　二維等高圖 圖105　假三維圖 　　列表模式其實(shí)只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計(jì)算機(jī)存貯方式，三個(gè)以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來(lái)完成的?？捎肔istMode中的特殊技術(shù)，開(kāi)窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來(lái)；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來(lái)。圖106給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。 　　圖106　從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意 　　上面簡(jiǎn)要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。 　?、跀?shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類(lèi)。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來(lái)自所測(cè)的數(shù)據(jù)。例如在測(cè)定老鼠精子的DNA含量時(shí)，可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來(lái)描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對(duì)測(cè)量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無(wú)設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡(jiǎn)單，只需要直觀觀測(cè)頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。 　　逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們?？梢杂脕?lái)了解數(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實(shí)上，不經(jīng)過(guò)先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對(duì)這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來(lái)看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。 　　逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對(duì)照組和測(cè)試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對(duì)每組測(cè)量，都要有對(duì)照組，對(duì)照組可以是空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、或零時(shí)刻對(duì)照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對(duì)照組和測(cè)試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯(cuò)誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時(shí)對(duì)曲線(xiàn)的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理，甚至對(duì)兩條曲線(xiàn)逐道相減而得到“差結(jié)果曲線(xiàn)”往往是適宜的。 因?yàn)閿?shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說(shuō)和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實(shí)例再介紹。離心機(jī)離心是蛋白質(zhì)、酶、核酸及細(xì)胞亞組分分離的最常用的方法之一，也是生化實(shí)驗(yàn)室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經(jīng)成為研究生物大分子實(shí)驗(yàn)室中的常用技術(shù)方法。 離心機(jī)(centrifuge)是實(shí)施離心技術(shù)的裝置。離心機(jī)的種類(lèi)很多，按照使用目的，可分為兩類(lèi)，即制備型離心機(jī)和分析型離心機(jī)。前者主要用于分離生物材料，每次分離樣品的容量比較大，后者則主要用于研究純品大分子物質(zhì)，包括某些顆粒體如核蛋白體等物質(zhì)的性質(zhì)，每次分析的樣品容量很小，根據(jù)待測(cè)物質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為(可用離心機(jī)中的光學(xué)系統(tǒng)連續(xù)地監(jiān)測(cè))，能推斷其純度、形狀和相對(duì)分子質(zhì)量等性質(zhì)。這兩類(lèi)離心機(jī)由于用途不同，故其主要結(jié)構(gòu)也有差異。離心原理將樣品放入離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機(jī)驅(qū)動(dòng)時(shí)，樣品液就隨離心管做勻速圓周運(yùn)動(dòng)，于是就產(chǎn)生了一個(gè)向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場(chǎng)中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互間的分離。 離心力和相對(duì)離心力：溶液中的固相顆粒做圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)向外離心力，其定義為：F = mω2r式中： F 為離心力的強(qiáng)度； m 為沉降顆粒的有效質(zhì)量；ω 為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)的角速度，其單位為rad/s；r 為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。很顯然，離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。目前離心力通常以相對(duì)離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對(duì)于地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計(jì)算公式如下：Fcf = 105(h)2rg可以看出，在同一轉(zhuǎn)速下，由于f 的不同，F(xiàn)cf相差會(huì)很大，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般取平均值。在離心實(shí)驗(yàn)的報(bào)告中，F(xiàn)cf、r 平均、離心時(shí)間t 和液相介質(zhì)等條件都應(yīng)表示出來(lái)，因?yàn)樗鼈兌寂c樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系。顯然Fcf是一個(gè)只與離心機(jī)相關(guān)的參數(shù)，而與樣品并無(wú)直接的關(guān)系。 沉降速度與沉降系數(shù)一個(gè)顆粒要沉降，它必須置換出位于它下方等體積的溶液，這只有當(dāng)顆粒的質(zhì)量大于被置換出的液體的質(zhì)量時(shí)才能通過(guò)離心的手段達(dá)到，否則，在離心過(guò)程中顆粒將發(fā)生向上漂浮，而不是下沉。當(dāng)顆粒在運(yùn)動(dòng)時(shí)，不論方向如何，它都要穿過(guò)溶劑分子，所產(chǎn)生的摩擦力總是與顆粒運(yùn)動(dòng)的方向相反