【正文】 病毒的基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尚無質(zhì)粒型的痘苗病毒克隆載體，因此必須采用 同源重組 方法構(gòu)建 痘苗病毒克隆載體特點(diǎn) ： 1） 表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的活性和理化性質(zhì)相近 2）外源目的基因和載體的免疫原性均較好 3）外源基因的插入量大 4）宿主細(xì)胞廣泛 5）表達(dá)產(chǎn)物可翻譯后修飾，無需佐劑，純化簡(jiǎn)單，產(chǎn)物穩(wěn)定，易于保存運(yùn)輸 十、桿狀病毒克隆載體 自學(xué)要點(diǎn)： 基因組特性，同源重組方式，陽性克隆檢測(cè)，表達(dá)特點(diǎn)。 思考題 名詞解釋： Cos位點(diǎn)、受納細(xì)胞、非受納細(xì)胞 構(gòu)建 λ 噬菌體載體的策略及其技術(shù)路線。 試從 cosmid克隆載體的構(gòu)建策略上說明其特征。 簡(jiǎn)述病毒的溶原性和溶菌性增殖途徑。 M13噬菌體載體有何優(yōu)點(diǎn)和用途？ 簡(jiǎn)述腺病毒克隆載體的策略及其主要用途。 痘苗病毒克隆載體有何特點(diǎn)？為什么要用同源重組方式構(gòu)建？ 如何構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體？舉例說明。 3． 3 染色體定位整合克隆載體 質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足： 轉(zhuǎn)基因生物中游離的外源 DNA分子能多拷貝復(fù)制，但易丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性 隨機(jī)插入染色體的外源 DNA片段能穩(wěn)定維持，但因插入的位點(diǎn)不確定，可能干擾受體細(xì)胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致有害突變，造成選育轉(zhuǎn)基因生物不可知性，增加難度 基因整合平臺(tái)系統(tǒng) ——基因定位同源重組 (基因打靶 ) 整合平臺(tái)：即受體細(xì)胞基因組上給定的 DNA區(qū)域，是外源 DNA 定位整合的位置 定位整合克隆載體：除一般質(zhì)?？寺≥d體必備的元件外，還 含有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺(tái) DNA區(qū)域核酸序列同源的 DNA片段（長(zhǎng)度最好＞ 1kb） 一、定位整合克隆載體的幾種模式 （一）內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體 （二）外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體 （三）內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體 （四）內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體 二、定位整合效率 ? 與受體細(xì)胞的種屬和同源 DNA片段的長(zhǎng)短有關(guān) ? 整合效率偏低，有待改進(jìn) 三、定位整合克隆載體 受體生物：原核生物藍(lán)細(xì)菌、高等植物（擬南芥、水稻等）的原生質(zhì)體、動(dòng)物鼠的胚胎干細(xì)胞、人的細(xì)胞 整合平臺(tái)：內(nèi)源 isiAB、 cpcB2A hprt、 rDNA 外源 hptΔ 、 aphⅡ （一）藍(lán)藻染色體定位整合克隆載體 絲狀藍(lán)藻 Calothrix 獲得含藻藍(lán)蛋白基因 cpcB2A2的 DNA片段，以之為同源序列，構(gòu)建～ 從其 cpc2操縱子中擴(kuò)贈(zèng)出 cpc2啟動(dòng)區(qū)（約 ）、同源 DNA片段 L（約 ）和 R（約 ）構(gòu)建如下載體： Synechococcus 從 isiAB基因的約 DNA片段，構(gòu)建 p ZL： 不含藍(lán)藻源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，故不能在藍(lán)藻細(xì)胞質(zhì)中自行復(fù)制 （二）酵母菌染色體定位整合克隆載體 （三）植物染色體定位整合克隆載體 易于控制；避免插入失活或突變。 （四）動(dòng)物染色體定位整合克隆載體 ３．４ 人工染色體克隆載體 一、人工染色體克隆載體含義和特點(diǎn) 實(shí)際上是一種 “ 穿梭 ” 克隆載體：含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ ori），還含有第二受體（如酵母菌）染色體 DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。 特點(diǎn)：能容納長(zhǎng)達(dá) 1000至 3000kb的外源 DNA片段。 二、人工染色體克隆載體的構(gòu)建 YAC（酵母人工染色體） 常用載體： pYAC pYAC pYAC5 三、人工染色體克隆載體的應(yīng)用 ? 構(gòu)建基因組文庫(kù) ? 基因治療 ? 基因功能鑒定 ? ３．５ 特殊用途克隆載體 ? 一、啟動(dòng)子探針型克隆載體 ? 應(yīng)用范圍： ? 研究生物的發(fā)育機(jī)制 ? 提高目的基因表達(dá)產(chǎn)量 ? 進(jìn)行基因治療 ? 組成結(jié)構(gòu)：必備轉(zhuǎn)化系統(tǒng) + 檢測(cè)部件 ? 檢測(cè)部件：一個(gè)已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因及克隆位點(diǎn)。 Kanr標(biāo)記 ：用于植物細(xì)胞 Kanr基因 → Kanr蛋白 卡那霉素 磷酸化卡那霉素 → 不能進(jìn)入細(xì)胞 ATP gfp標(biāo)記 : 用于真核及原核細(xì)胞 gfp基因 → GFP（綠色熒光蛋白 ) 395nm/470nm 發(fā)射 510nm（綠色熒光） hph標(biāo)記 : 用于真核及原核細(xì)胞 潮霉素 B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（ hph） 二、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體 指啟動(dòng)子必須在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或比較高的轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)克隆載體 誘導(dǎo)條件：二價(jià)金屬離子、紅光、熱、干旱 金屬硫蛋白（ MT）啟動(dòng)子 干旱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體 ? 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)積累 果聚糖和海藻糖能不同程度地提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性。 ? 干旱誘導(dǎo)性啟動(dòng)子： Prd29A 紅光誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體 ? 藻藍(lán)蛋白操縱子 2（ cpc2)→ 藍(lán)藻表達(dá)克隆載體 pUTK2（圖 334） 熱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體 ? groESL啟動(dòng)子 → 藍(lán)藻基因整合平臺(tái)表達(dá)克隆載體 pZL（圖 335） 三、反義表達(dá)克隆載體 人工干預(yù)基因表達(dá) ? 利用人工合成或重組的、與靶基因互補(bǔ)的一段反義DNA或 RNA片段，特異性地與靶基因結(jié)合，從而達(dá)到封閉其表達(dá)的目的。 ? 應(yīng)用： 基因治療 和基因功能的研究 SOD基因反義表達(dá)克隆載體 NHE1基因反義表達(dá)克隆載體 ? 人肺癌細(xì)胞 Na+/H+交換泵 1（ NHE1） 四、組織特異性表達(dá)克隆載體 乳腺組織特異性表達(dá)克隆載體 ? 基因工程藥物的 生物反應(yīng)器 人凝血因子 Ⅸ 另外， EPO、 hALB均在動(dòng)物乳腺組織中得以表達(dá)。 腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)克隆載體 基因治療常用攜帶某種目的基因（ c DNA）的特定載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，希望能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)產(chǎn)物，殺傷腫瘤細(xì)胞。 ——?dú)[瘤細(xì)胞的同時(shí)，正常細(xì)胞也受到損傷。 ? 腫瘤細(xì)胞中特異性高效表達(dá)的啟動(dòng)子與腫瘤殺傷基因組成嵌合基因。 神經(jīng)組織特異性表達(dá)克隆載體 ? 早老性癡呆（ AD） 淀粉樣前體蛋白（ βAPP ） 衍生 神經(jīng)毒性多肽片段 Aβ 腦部形成淀粉樣斑塊 花藥特異性表達(dá)克隆載體（啟動(dòng)子 CA55） 種子特異性表達(dá)克隆載體 (啟動(dòng)子 7S) 五、分泌型表達(dá)克隆載體 六、雙啟動(dòng)子表達(dá)克隆載體 七、串聯(lián)啟動(dòng)子表達(dá)克隆載體 八、含增強(qiáng)子表達(dá)克隆載體 思考題 名詞解釋：人工染色體、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體 啟動(dòng)子探針型載體的檢測(cè)部件組成。 染色體定位整合系統(tǒng)的組成。