【正文】 載體 M13噬菌體載體體形圖 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13單鏈 DNA噬菌體的生命周期 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. M13 DNA載體的構建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列載體 lacZ′ polylinker 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13克隆載體MCS與分子結構圖 M13 DNA載體的特點： 使克隆的 DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外 這在 DNA定向突變中非常有用 M13重組分子篩選簡便 被 M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混 濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 第 3節(jié) 植物基因工程載體 Ti 質粒 YEP培養(yǎng)基上的根瘤農桿菌 LB培養(yǎng)基上的大腸桿菌 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌 農桿根瘤菌 （ ）感染所致，其致瘤特性是由該菌細胞內的野生 型質粒 Ti（ Tumorinducing）介導的。 ? Ti 質粒的結構與功能 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Ti 質粒的結構與功能 LB RBA u xi niaa Miaa H( t m s )C y t o ki n inip t Z( t m r )Op in e( t m t )Op in e代謝區(qū)復制起始區(qū)V ir 區(qū) T i pl a s m i dTi 質粒的圖譜 區(qū)代謝區(qū)復制起始區(qū)整個質粒 160 240 kb TDNA其中 TDNA 12 24 kb tms 的編碼產物負責： 合成吲哚乙酸 tmr 的編碼產物負責： 合成植物分裂素 tmt 的編碼產物負責： 合成氨基酸衍生物 冠癭堿 Ti 質粒的結構與功能 Ti 質粒致瘤的分子機制 損傷的植物根部會分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導 Ti質粒上的 vir基因以及根瘤菌染色體上的一個操縱子表達。 vir基因產物將 Ti質粒上的 TDNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達產物則與單鏈 TDNA結合形成復合物，后者轉化植物根部細胞。 植物根部乙酰丁香酸 羥基乙酰丁香酸植物細胞Ti 質粒單鏈 TD N A根瘤菌細胞Ti 質粒的結構與功能 TDNA的染色體整合機制 表達特異性核酸內切酶單鏈 T D N A 整合在植物的基因組上在 LB 和 RB 的第三和第四個堿基之間切開2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Agrobacterium tumefaciens, a soilborne αproteobacterium, has the capacity to transfer DNA from a resident tumor inducing (Ti) plasmid into eukaryotic cells where the oncogenic transferred DNA (TDNA) is integrated into the host genome and expressed. It is the only anism known to routinely engage in lateral gene transfer between Kingdoms, and the molecular basis of this transformation process has had considerable impact on studies of lateral DNA transfer and integration. In the case of Agrobacterium, virulent bacteria recognize signals produced at a host wound, phenols, monosaccharides, and low pH, as cues inducing expression of the Tiencoded virulence (vir) genes. The vir gene products, among other functions, are necessary for the processing and transport of the TDNA from the bacterium to the eukaryotic cell. TDNA的染色體整合機制 Ti 質粒的結構與功能 Ti 質粒的改造 除去 TDNA上的生長素 （ tms） 和分裂素 （ tmr） 生物合成基因 ， 因為大量的生長素和分裂素會抑止細胞再生長為整株植物； 除去 TDNA上的有機堿生物合成基因 （ tmt） ；因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸 ， 影響植物細胞的生長； 安裝大腸桿菌復制子 ， 使其能在大腸桿菌中復制 ， 以利于克隆操作； 安裝植物細胞的篩選標記 ， 如 neor 基因 ， 使用植物基因的啟動子和polyA化信號序列； 安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆 。 除去 Ti 質粒上的其它非必需序列 ， 最大限度地縮短載體的長度； 共整合轉化程序 大腸桿菌質粒大腸桿菌篩選標記農桿菌篩選標記多克隆位點重組質粒轉化大腸桿菌農桿菌細菌接合 T D N A 區(qū)同源整合農桿菌感染植物根部細胞 T D N A 區(qū)整合在植物細胞基因組上二元整合轉化程序 LB RBT DN A外源基因植物細胞篩選標記 Km r大腸桿菌 農桿菌穿梭質粒大腸桿菌篩選標記農桿菌篩選標記農桿菌 ori大腸桿菌 ori將外源基因克隆在大腸桿菌 農桿菌穿梭質粒的 TDNA區(qū)內； 重組質粒直接轉化農桿菌株 ， 該菌株攜帶只含 vir區(qū)不含 TDNA區(qū)的 Ti輔助質粒； 以上述重組農桿菌感染植物細胞 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 第 4節(jié) 人工染色體載體 artificial chromosome vectors 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往 需要 克隆數(shù)百 甚至上千 kb 的 DNA片段， 此時考斯質粒和噬菌粒載體的裝載 量也遠遠不能滿足需要。 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外 源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體， 它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 yeast artificial chromosome YAC 酵母人工染色體載體 目前常用的人造染色體載體包括： 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 bacterial artificial chromosome BAC 細菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 The essential elements for chromosome maintenance and transmission are the following three regions: (1) the “replication origin,” from which the duplication of DNA begins, (2) the “centromere,” which functions in proper chromosome segregation during cell division, and (3) the “telomere,” which protects the ends of linear chromosomes A human artificial chromosome (HAC) is a minichromosome that is constructed artificially in human cells 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 P1 artificial chromosomes,PAC, P1 人工染色體 transformationpetent artificial chromosome, TAC, 可轉化人工染色體 bacterial artificial chromosome , BIBAC, 雙元細菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Cloning vector Size of insert Standard high copy number plasmid vectors 010 kb Bacteriophage l insertion vectors 010 kb Bacteriophage l replacement vectors 923 kb Cosmid vectors 3044 kb Bacteriophage P1 70100 kb PAC (P1 artificial chromosome) vectors 130150 kb BAC (bacterial artificial chromosome) vectors up to 300 kb YAC (yeast artificial chromosome) vectors Mb 各類典型基因克隆載體的容量 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 酵母人工染色體載體 yeast artificial chromosome, YAC 1983年，美國的 DanaFarber癌癥研究所和哈佛大學醫(yī)學院的教授首次在 Nature上發(fā)表文章，報道了構建 YAC（ Yeast Artificial Chromosome）庫的過程。 YAC 載體在酵母中 復制的必需元件包括 自主復制序列（ autonomously replicating sequence， ARS） 著絲粒 （ centromere , CEN） 兩個端粒（ TEL） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping The functional elements of a yeast chromosome 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 正常酵母人工染色體含有： 四膜蟲端粒（ tel) 酵母自主復制序列（ ARS) 酵母著絲點 (CEN)