【正文】 載體 M13噬菌體載體體形圖 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13單鏈 DNA噬菌體的生命周期 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. M13 DNA載體的構(gòu)建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列載體 lacZ′ polylinker 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13克隆載體MCS與分子結(jié)構(gòu)圖 M13 DNA載體的特點(diǎn)： 使克隆的 DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外 這在 DNA定向突變中非常有用 M13重組分子篩選簡(jiǎn)便 被 M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成混 濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 第 3節(jié) 植物基因工程載體 Ti 質(zhì)粒 YEP培養(yǎng)基上的根瘤農(nóng)桿菌 LB培養(yǎng)基上的大腸桿菌 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會(huì)形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌 農(nóng)桿根瘤菌 （ ）感染所致，其致瘤特性是由該菌細(xì)胞內(nèi)的野生 型質(zhì)粒 Ti（ Tumorinducing）介導(dǎo)的。 ? Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 LB RBA u xi niaa Miaa H( t m s )C y t o ki n inip t Z( t m r )Op in e( t m t )Op in e代謝區(qū)復(fù)制起始區(qū)V ir 區(qū) T i pl a s m i dTi 質(zhì)粒的圖譜 區(qū)代謝區(qū)復(fù)制起始區(qū)整個(gè)質(zhì)粒 160 240 kb TDNA其中 TDNA 12 24 kb tms 的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)： 合成吲哚乙酸 tmr 的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)： 合成植物分裂素 tmt 的編碼產(chǎn)物負(fù)責(zé)： 合成氨基酸衍生物 冠癭堿 Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 Ti 質(zhì)粒致瘤的分子機(jī)制 損傷的植物根部會(huì)分泌出乙酰丁香酸和羥基乙酰丁香酸，它們能誘導(dǎo) Ti質(zhì)粒上的 vir基因以及根瘤菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。 vir基因產(chǎn)物將 Ti質(zhì)粒上的 TDNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈 TDNA結(jié)合形成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。 植物根部乙酰丁香酸 羥基乙酰丁香酸植物細(xì)胞Ti 質(zhì)粒單鏈 TD N A根瘤菌細(xì)胞Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 TDNA的染色體整合機(jī)制 表達(dá)特異性核酸內(nèi)切酶單鏈 T D N A 整合在植物的基因組上在 LB 和 RB 的第三和第四個(gè)堿基之間切開2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Agrobacterium tumefaciens, a soilborne αproteobacterium, has the capacity to transfer DNA from a resident tumor inducing (Ti) plasmid into eukaryotic cells where the oncogenic transferred DNA (TDNA) is integrated into the host genome and expressed. It is the only anism known to routinely engage in lateral gene transfer between Kingdoms, and the molecular basis of this transformation process has had considerable impact on studies of lateral DNA transfer and integration. In the case of Agrobacterium, virulent bacteria recognize signals produced at a host wound, phenols, monosaccharides, and low pH, as cues inducing expression of the Tiencoded virulence (vir) genes. The vir gene products, among other functions, are necessary for the processing and transport of the TDNA from the bacterium to the eukaryotic cell. TDNA的染色體整合機(jī)制 Ti 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 Ti 質(zhì)粒的改造 除去 TDNA上的生長(zhǎng)素 （ tms） 和分裂素 （ tmr） 生物合成基因 ， 因?yàn)榇罅康纳L(zhǎng)素和分裂素會(huì)抑止細(xì)胞再生長(zhǎng)為整株植物； 除去 TDNA上的有機(jī)堿生物合成基因 （ tmt） ；因?yàn)橛袡C(jī)堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸 ， 影響植物細(xì)胞的生長(zhǎng)； 安裝大腸桿菌復(fù)制子 ， 使其能在大腸桿菌中復(fù)制 ， 以利于克隆操作； 安裝植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記 ， 如 neor 基因 ， 使用植物基因的啟動(dòng)子和polyA化信號(hào)序列； 安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆 。 除去 Ti 質(zhì)粒上的其它非必需序列 ， 最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度； 共整合轉(zhuǎn)化程序 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記多克隆位點(diǎn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌農(nóng)桿菌細(xì)菌接合 T D N A 區(qū)同源整合農(nóng)桿菌感染植物根部細(xì)胞 T D N A 區(qū)整合在植物細(xì)胞基因組上二元整合轉(zhuǎn)化程序 LB RBT DN A外源基因植物細(xì)胞篩選標(biāo)記 Km r大腸桿菌 農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌 ori大腸桿菌 ori將外源基因克隆在大腸桿菌 農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的 TDNA區(qū)內(nèi)； 重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株 ， 該菌株攜帶只含 vir區(qū)不含 TDNA區(qū)的 Ti輔助質(zhì)粒； 以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 第 4節(jié) 人工染色體載體 artificial chromosome vectors 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往 需要 克隆數(shù)百 甚至上千 kb 的 DNA片段， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載 量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外 源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體， 它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 yeast artificial chromosome YAC 酵母人工染色體載體 目前常用的人造染色體載體包括： 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 bacterial artificial chromosome BAC 細(xì)菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 The essential elements for chromosome maintenance and transmission are the following three regions: (1) the “replication origin,” from which the duplication of DNA begins, (2) the “centromere,” which functions in proper chromosome segregation during cell division, and (3) the “telomere,” which protects the ends of linear chromosomes A human artificial chromosome (HAC) is a minichromosome that is constructed artificially in human cells 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 P1 artificial chromosomes,PAC, P1 人工染色體 transformationpetent artificial chromosome, TAC, 可轉(zhuǎn)化人工染色體 bacterial artificial chromosome , BIBAC, 雙元細(xì)菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Cloning vector Size of insert Standard high copy number plasmid vectors 010 kb Bacteriophage l insertion vectors 010 kb Bacteriophage l replacement vectors 923 kb Cosmid vectors 3044 kb Bacteriophage P1 70100 kb PAC (P1 artificial chromosome) vectors 130150 kb BAC (bacterial artificial chromosome) vectors up to 300 kb YAC (yeast artificial chromosome) vectors Mb 各類典型基因克隆載體的容量 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 酵母人工染色體載體 yeast artificial chromosome, YAC 1983年，美國(guó)的 DanaFarber癌癥研究所和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的教授首次在 Nature上發(fā)表文章，報(bào)道了構(gòu)建 YAC（ Yeast Artificial Chromosome）庫的過程。 YAC 載體在酵母中 復(fù)制的必需元件包括 自主復(fù)制序列（ autonomously replicating sequence， ARS） 著絲粒 （ centromere , CEN） 兩個(gè)端粒（ TEL） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 the capacity to clone large exogenous DNA fragments (up to 2 Mb) has made YACs a vital tool in physical mapping The functional elements of a yeast chromosome 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 正常酵母人工染色體含有： 四膜蟲端粒（ tel) 酵母自主復(fù)制序列（ ARS) 酵母著絲點(diǎn) (CEN)