基因工程載體-噬菌體載體-資料下載頁
2024-09-20 21:10本頁面
【正文】 T四、柯斯質(zhì)粒載體 柯斯質(zhì)粒 (cosmid) 一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了 λ噬菌體的 cos基因?？滤官|(zhì)粒能被包裝到 λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細菌的 DNA片段（超過 45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大 （一）粘粒 (cosmid) 組成： 2. 抗性基因； 1. 質(zhì)粒復制的起始位點 (ORI)； 3. 用于插入目的基因的單個酶切位點； 4. ?噬菌體的 cos位點 。 可見， cosmid是由質(zhì)粒和 ?噬菌體的cos位點 構(gòu)建而成。 與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個優(yōu)點： ?（ 1）具有 cos位點，能高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，能在大腸桿菌中實現(xiàn)自身環(huán)化，并能在大腸桿菌中復制； ?（ 2）有像質(zhì)粒一樣的選擇標記； ?（ 3） cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的長度在 15~45 kb之間。 由于 cosmid載體的大片段克隆能力，多用于基因組文庫的構(gòu)建，而 λ噬菌體載體多用于 cDNA文庫的構(gòu)建。已有多種粘粒載體可用于基因克隆， pJB8是最常用的粘粒載體之一 （ 4) 多種單一酶切位點，便于克隆 粘粒載體的優(yōu)點 柯斯質(zhì)粒載體的特點 1. 具有 λ噬菌體的特性； 2. 具有質(zhì)粒載體的特性； 3. 具有較高容量的克隆能力； 4. 具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力 特點： 27～ 41kb的外源基因，方便地用于 克隆大片段 DNA。 ?噬菌體 頭部和尾部蛋白，可將 粘粒包裝成類似于 ?噬菌體 的具感染能力的顆粒，方便地進入大腸桿菌。 噬菌體 的功能，而表現(xiàn) 質(zhì)粒 的特性。 柯斯質(zhì)粒載體 cosmid載體 ：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段 DNA的載體，它是由 λ 噬菌體的cos（ cohesive）末端及質(zhì)粒（ plasmid）重組而成的載體。 cosmid載體帶有質(zhì)粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及 λ 噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒 DNA的形式存在于細胞內(nèi)。 柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒 pBR322和噬菌體 λ 的cos位點的一段 DNA構(gòu)成全長 設(shè)計構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長 4～ 6kb。其上的 cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有 cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體 λ 的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源 DNA可大于 40kb。重組的柯斯質(zhì)?？上笫删w λ 一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制。 Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vectortarget concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences. 采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難 ① 載體自身只相當于可以插入片段的 1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接； ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度； ③ 細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費時間?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源 DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。 OVer!!!
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