基因工程3載體中國藥科大學生物工程所有-資料下載頁
2025-01-08 16:34本頁面
【正文】 13噬菌體本身和寄主菌株兩個組成部分。但無論 M13載體，還是大腸桿菌寄主菌株（如 JM101），單獨都不能產生有功能活性的 β 半乳糖苷酶，而這種酶的活性可以用 Xgal顯色法測定出來。 在 M13體系中，已將 Lac阻遏基因的 Iq突變引入宿主細胞。該 Iq突變基因可產生出 10余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制 Lac操縱子的表達。 IPTG是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導細胞合成半乳糖苷酶。因此， IPTG被稱為 β半乳糖苷酶的 安慰誘導物 。 安慰誘導劑 M13載體系列的優(yōu)點 ①單鏈 DNA噬菌體的復制是以雙鏈環(huán)形 DNA為中 間媒介的，這種 RFDNA可以如同質粒 DNA一樣， 在體外進行純化和操作。 ②不論是 RFDNA還是 ssDNA，它們都能夠轉染感 受態(tài)的 ③單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA多寡 的制約，因此，并不存在包裝限制。 ④ 應用這類單鏈 DNA噬菌體，可以容易地控制外 源 DNA片段的插入取向。 ⑤可產生大量純化的含外源 DNA片段插入的單鏈 DNA分子。這種單鏈 DNA分子可按雙脫氧鏈終 止法做核苷酸序列測定，也可用于制備具放射 性同位素標記的 DNA探針，可以進行寡核苷酸 定點突變。 總之， M13載體兼具質粒載體與 λ 噬菌體的優(yōu)點。 采用 Sanger雙脫氧鏈終止 DNA測序法： 測序三要素： 模板 —— DNA母鏈。新合成鏈按堿基互補原則（ AT， CG）進行。 引物 —— DNA短鏈。起起始合成作用。 酶、底物（ dATP、 dTTP、 dGTP、dCTP)和非正常底物（ ddATP、 ddTTP、ddGTP、 ddCTP) 。 DNA序列測定法 三、真核基因病毒載體 病毒載體優(yōu)點是： 有很高的拷貝數(shù)； 強大的啟動子，可保證外源基因的高效表達； 可保證糖基化。 常用的有 SV40病毒載體 及 昆蟲桿狀病毒載體 。 真核基因表達載體應具備的條件： 含有原核基因的復制起始序列（如 ColEI起始序列 ori）以及篩選標記（如使 Ampr的 β 內酰胺酶基因 ）。這樣便于在 和篩選。 含有真核基因的復制起始序列（如 SV40病毒的復制序列、酵母自主復制序列）以及真核細胞篩選標記（如氨基糖苷 G418抗性基因，在酵母中與自養(yǎng)有關的基因）。 含有有效的啟動子序列（可包含增強子序列等各種順式作用元件 cisacting element），保證在其下游的外源基因進行有效的轉錄起始。 RNA聚合酶 II所需的轉錄終止和 poly(A)加入的信號序列。 合適的供外源基因插入的限制性內切酶位點。 SV40病毒載體 (simian vacuolating virus 40 vector) SV40病毒 DNA位環(huán)狀雙螺旋結構，長度為 5224bp，其基因組分為早期區(qū)域和晚期區(qū)域，前者在整個病毒生長循環(huán)中均可表達，后者則在 DNA復制開始后的一段時間內表達，產生病毒外殼蛋白。 SV40 DNA ori VP2 T VP3 VP1 t pV2(gpt)即為一個 SV40載體 它包括 pBR322的大腸桿菌復制起始位點；氨芐青霉素抗性基因；大腸桿菌谷丙轉氨酶基因 gpt和 SV40的哺乳動物細胞復制起始位點以及其他一些在哺乳動物細胞中表達所必須的序列。重組子可以通過對 gpt進行篩選。 利用 SV40載體 生產外源蛋白 過程的示意圖 : SV40 DNA為載體的取代克隆方式又分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類型。 晚期基因區(qū)域取代方式 是以外源性 DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構成的重組 DNA在宿主中可以復制，但不能產生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的 SV40病毒突變種作為 輔助病毒 與晚期取代重組 DNA或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組 DNA可獲得 標記營救 ，輔助病毒產生的晚期基因產物與重組病毒的早期基因產物一起可形成完整病毒顆粒。 早期區(qū)域取代方式 是以外源性 DNA片段取代早期基因區(qū)域，但重組 DNA形成病毒顆粒與早期區(qū)域基因產物 T抗原供應有關，故同樣可采用晚期基因區(qū)域缺失的 SV40突變種作為輔助病毒進行 標記營救 ，即可形成完整病毒顆粒。 SV40病毒載體的宿主為動物細胞。表達產物有糖基化。目前很多基因工程藥物如 EPO， TPA， β 珠蛋白及抗體藥物可用其表達。
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