基因工程3載體中國藥科大學(xué)生物工程所有-資料下載頁
2025-01-08 16:34本頁面
【正文】 13噬菌體本身和寄主菌株兩個組成部分。但無論 M13載體，還是大腸桿菌寄主菌株（如 JM101），單獨(dú)都不能產(chǎn)生有功能活性的 β 半乳糖苷酶，而這種酶的活性可以用 Xgal顯色法測定出來。 在 M13體系中，已將 Lac阻遏基因的 Iq突變引入宿主細(xì)胞。該 Iq突變基因可產(chǎn)生出 10余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制 Lac操縱子的表達(dá)。 IPTG是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成半乳糖苷酶。因此， IPTG被稱為 β半乳糖苷酶的 安慰誘導(dǎo)物 。 安慰誘導(dǎo)劑 M13載體系列的優(yōu)點(diǎn) ①單鏈 DNA噬菌體的復(fù)制是以雙鏈環(huán)形 DNA為中 間媒介的，這種 RFDNA可以如同質(zhì)粒 DNA一樣， 在體外進(jìn)行純化和操作。 ②不論是 RFDNA還是 ssDNA，它們都能夠轉(zhuǎn)染感 受態(tài)的 ③單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA多寡 的制約，因此，并不存在包裝限制。 ④ 應(yīng)用這類單鏈 DNA噬菌體，可以容易地控制外 源 DNA片段的插入取向。 ⑤可產(chǎn)生大量純化的含外源 DNA片段插入的單鏈 DNA分子。這種單鏈 DNA分子可按雙脫氧鏈終 止法做核苷酸序列測定，也可用于制備具放射 性同位素標(biāo)記的 DNA探針，可以進(jìn)行寡核苷酸 定點(diǎn)突變。 總之， M13載體兼具質(zhì)粒載體與 λ 噬菌體的優(yōu)點(diǎn)。 采用 Sanger雙脫氧鏈終止 DNA測序法： 測序三要素： 模板 —— DNA母鏈。新合成鏈按堿基互補(bǔ)原則（ AT， CG）進(jìn)行。 引物 —— DNA短鏈。起起始合成作用。 酶、底物（ dATP、 dTTP、 dGTP、dCTP)和非正常底物（ ddATP、 ddTTP、ddGTP、 ddCTP) 。 DNA序列測定法 三、真核基因病毒載體 病毒載體優(yōu)點(diǎn)是： 有很高的拷貝數(shù)； 強(qiáng)大的啟動子，可保證外源基因的高效表達(dá)； 可保證糖基化。 常用的有 SV40病毒載體 及 昆蟲桿狀病毒載體 。 真核基因表達(dá)載體應(yīng)具備的條件： 含有原核基因的復(fù)制起始序列（如 ColEI起始序列 ori）以及篩選標(biāo)記（如使 Ampr的 β 內(nèi)酰胺酶基因 ）。這樣便于在 和篩選。 含有真核基因的復(fù)制起始序列（如 SV40病毒的復(fù)制序列、酵母自主復(fù)制序列）以及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記（如氨基糖苷 G418抗性基因，在酵母中與自養(yǎng)有關(guān)的基因）。 含有有效的啟動子序列（可包含增強(qiáng)子序列等各種順式作用元件 cisacting element），保證在其下游的外源基因進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄起始。 RNA聚合酶 II所需的轉(zhuǎn)錄終止和 poly(A)加入的信號序列。 合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 SV40病毒載體 (simian vacuolating virus 40 vector) SV40病毒 DNA位環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu)，長度為 5224bp，其基因組分為早期區(qū)域和晚期區(qū)域，前者在整個病毒生長循環(huán)中均可表達(dá)，后者則在 DNA復(fù)制開始后的一段時間內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生病毒外殼蛋白。 SV40 DNA ori VP2 T VP3 VP1 t pV2(gpt)即為一個 SV40載體 它包括 pBR322的大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因；大腸桿菌谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因 gpt和 SV40的哺乳動物細(xì)胞復(fù)制起始位點(diǎn)以及其他一些在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)所必須的序列。重組子可以通過對 gpt進(jìn)行篩選。 利用 SV40載體 生產(chǎn)外源蛋白 過程的示意圖 : SV40 DNA為載體的取代克隆方式又分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類型。 晚期基因區(qū)域取代方式 是以外源性 DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構(gòu)成的重組 DNA在宿主中可以復(fù)制，但不能產(chǎn)生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的 SV40病毒突變種作為 輔助病毒 與晚期取代重組 DNA或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組 DNA可獲得 標(biāo)記營救 ，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒的早期基因產(chǎn)物一起可形成完整病毒顆粒。 早期區(qū)域取代方式 是以外源性 DNA片段取代早期基因區(qū)域，但重組 DNA形成病毒顆粒與早期區(qū)域基因產(chǎn)物 T抗原供應(yīng)有關(guān)，故同樣可采用晚期基因區(qū)域缺失的 SV40突變種作為輔助病毒進(jìn)行 標(biāo)記營救 ，即可形成完整病毒顆粒。 SV40病毒載體的宿主為動物細(xì)胞。表達(dá)產(chǎn)物有糖基化。目前很多基因工程藥物如 EPO， TPA， β 珠蛋白及抗體藥物可用其表達(dá)。
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