基因克隆載體ppt課件-資料下載頁
2025-03-22 06:18本頁面
【正文】 六節(jié) 基因定位整合克隆載體 為了保證外源 DNA在細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳并不對(duì)宿主細(xì)胞的代謝產(chǎn)生較大的影響，建立基因整合平臺(tái)系統(tǒng)，使外源基因定位整合到染色體特定的位點(diǎn)．它包括整合平臺(tái)和整合克隆載體兩部分． 整合平臺(tái)：受體細(xì)胞基因組上給定的 DNA區(qū)域． 整合克隆載體：含有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺(tái)區(qū)核苷酸序列同源的 DNA片斷． 外源 DNA整合到染色體上 1) 內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體 2) 外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體 3) 內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體 4) 內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體 2. 整合克隆載體的整合效率 基因定位整合的效率與受體細(xì)胞的種屬和同源DNA片斷的長(zhǎng)短有關(guān)． 鼠胚胎干細(xì)胞 hprt基因整合平臺(tái)系統(tǒng)定位整合效率 ?細(xì)菌染色體基因定位整合載體 ?藍(lán)藻染色體基因定位整合載體 ?酵母染色體基因定位整合載體 ?植物染色體基因定位整合載體 ?動(dòng)物染色體基因定位整合載體 第七節(jié) 人造染色體載體 1. 細(xì)菌人造染色體 (BAC)載體 2. 酵母人造染色體（ YAC）載體 人造酵母染色體（ Yeast Artificial Chromosome） a）保持染色體穩(wěn)定所必需的順式作用因子被 確定． b）建立了酵母高效表達(dá)系統(tǒng)． c）建立了大片段 DNA分離的方法（脈沖場(chǎng)凝膠 電泳 ）． 目的：用于克隆大于 100 kb的基因組 DNA．某些 基因如人凝血因子 VII基因長(zhǎng)達(dá) 180kb，肌 營(yíng)養(yǎng)不良基因大于 1800 kb． 1) pYAC4人造染色體 2) YAC克隆載體的應(yīng)用 構(gòu)建基因組文庫或克隆外源基因 :利用 YAC構(gòu)建基因組文庫或克隆外源基因的過程類似于原核生物基因組文庫的構(gòu)建和 DNA的克隆過程，通過酶切、酶連和轉(zhuǎn)化等一系列過程．在含有單臂或雙臂所需成分的瓊脂糖平板上鑒定保持人工染色體的酵母染色體．當(dāng) DNA插入到克隆位點(diǎn)后，打斷了抑制型 tRNA基因，致使帶 ade ?琥珀突變基因的酵母株形成紅色而不是白色的菌落． YAC克隆基因中的注意事項(xiàng) 基因組在剪切力相對(duì)較小的環(huán)境中制備，以得到平均數(shù)千 kb的 DNA片段． 以稀切限制酶不完全切割 DNA片段，產(chǎn)生200500 kb的 DNA片段（稀切酶可以減少文庫中的重疊克隆子）． 以酵母球形體轉(zhuǎn)化重組 YAC克隆載體，提高轉(zhuǎn)化效率（ 500個(gè)轉(zhuǎn)化體 /?g DNA）． 第八節(jié) 基因表達(dá)載體 1 原核生物基因表達(dá)載體 1) 特點(diǎn)： a）含有強(qiáng)的啟動(dòng)子（如 trp啟動(dòng)子） b）含有 lac Z核糖體的結(jié)合位點(diǎn) c）含起始密碼的基因插入到 MCS均能表達(dá) d）含有強(qiáng)的終止子（ 核糖體 RNA終止子 rrnB） e）表達(dá)產(chǎn)物為單一蛋白 三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖 T A AA T G I II II I I V V I V I II VA T G I II II I VIIIIIIO r i轉(zhuǎn)錄起始 翻譯起始 信號(hào)肽 成熟蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)CSCSCSC S c l o n i n g si t e p P C φ 1 ATG － G A A T T C C T T A A G p P C φ 1 ATG － G G A A T T C C C T T A A G pPC φ 1 ATG － G G G A A T T C C C C T T A A G原核生物基因表達(dá)載體 pKK2233 2 ） 原核生物基因融合表達(dá)載體 一般特性： a）含有高水平表達(dá)的啟動(dòng)子 b）基因的表達(dá)可被誘導(dǎo) （化學(xué)物、溫度等） c）在原核宿主中表達(dá)，產(chǎn)物為融合蛋白 d）表達(dá)產(chǎn)物易于分離純化 GST基因融合表達(dá)載體（ pGEX5X3） 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 （ glutathione Stransferase， GST） 蛋白 A基因融合表達(dá)載體 (pEZZ18) 特點(diǎn) : a) 含有蛋白 A信息序列和兩個(gè)合成 Z區(qū)． b) 表達(dá)產(chǎn)物為分泌蛋白， Z區(qū)可與 IgG－ Sepharose 6FF結(jié)合，易于純化表達(dá)產(chǎn)物． pEZZ18載體 pMC1871融合表達(dá)載體 特點(diǎn)：含有 ?半乳糖苷酶，外源基因插入 lac Z基因中，表達(dá)雜合蛋白，而雜合蛋白的 ?半乳糖苷酶活性可作為檢測(cè)標(biāo)記． pMC1871載體 （ pKSV10） 特點(diǎn)： a）穿梭質(zhì)粒載體（可在 中復(fù)制保存）． b）含有質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn)和抗性標(biāo)記（ Apr）． （ pCaMVCN） 特點(diǎn)： a） 含有 CaMV35S啟動(dòng)子和 Tn9的 Cat基因． b）在單子葉植物和雙子葉植物中均有活性 ． 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (baculovirus expression system) 目前被廣泛應(yīng)用的是苜 蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒 (AcMNPV),屬一種溶原性病毒?；蚪M為雙鏈 DNA， 可感染節(jié)肢動(dòng)物。 國(guó)內(nèi) 應(yīng)用的是家蠶核多角病毒。 特殊用途克隆載體 ? 啟動(dòng)子探針型克隆載體 ? 誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體 ? 反義表達(dá)克隆載體 ? 組織特異性表達(dá)克隆載體 ? 含增強(qiáng)子表達(dá)載體 ? 。 作業(yè)題 ： 1. 根據(jù)已有的質(zhì)粒載體構(gòu)建基因克隆載體，要求新構(gòu)建的克隆載體能在含氨芐青霉素（ Apr）和卡那霉素 (Kar)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，有可插入外源 DNA片段的多克隆位點(diǎn) (MCS)，且分子量小于 kb． (E: EcoR I； B： BamH I； K： Kpn I)。 2. 如何將野生型細(xì)菌質(zhì)粒改造為基因克隆載體？ 3. YAC載體具有那些特性？
規(guī)章制度相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1