【正文】 arget protein in cell, units LOGO Where your expressed protein will be located? Inclusion bodies (insoluble) Cytoplasm (soluble) Secreted into periplasmatic space (soluble or insoluble) Nothing Rebinant protein may be hydrolyzed by proteinases resistant to proteinase hydrolysis that results in the high yield LOGO SDSPAGE Purify and Identify the protein Western Blot Analysis 問題： 是不是所有基因都可以在 ？ LOGO 外源基因在原核細胞表達的必要條件 ： 5’非編碼區(qū) SD順序控制下 （ ORF） ，形成的蛋白質(zhì)不被降解 LOGO 真核基因在 ？ （ 1）基因片段應(yīng)該來源于 mRNA，因為 。 真核基因 原核基因 斷裂 基因 連續(xù) 基因 采用 RTPCR法 LOGO （ 2）盡量將密碼子改變成 ，如果有困難，可嘗試將基因 5’端前 50個堿基變成偏愛密碼子。 U C A G U 10 UUU Phe F 23 UUC Phe F 1 UUA Leu L 2 UU G Leu L 18 UCU Ser S 18 UCC Ser S 1 UCA Ser S 1 UCG Ser S 3 UAU Tyr Y 13 UAC Tyr Y UAA ( 赭石 ) UAG ( 琥珀 ) 1 UGU Cys C 6 UGC Cys C UGA （乳白） 3 U GG Trp W C 4 CUU Leu L 3 CUC Leu L 0 CUA Leu L 79 CUG Leu L 3 CCU Pro P 0 CCC Pro P 4 CCA Pro P 36 CCG Pro P 3 CAU His H 15 CAC His H 9 CAA Gln Q 33 CAG Gln Q 48 CGU Arg R 26 CGC Arg R 0 CGA Arg R 0 CGG Arg R A 13 AUU Ile I 51 AUC Ile I 0 AUA Ile I 30 AUG Met M 36 ACU Thr T 26 ACC Thr T 3 ACA Thr T 0 ACG Thr T 3 AAU Asn N 42 AAC Asn N 90 AAA Lys K 24 AAG Lys K 1 AGU Ser S 12 AGC Ser S 1 AGA Arg R 0 AGG Arg R G 54 GUU Val V 6 GUC Val V 40 GUA Val V 16 GUG Val V 93 GCU Ala A 10 GCC Ala A 45 GCA Ala A 28 GCG Ala A 17 GAU Asp D 45 GAC Asp D 61 GAA Glu E 16 GAG Glu E 49 GGU Gly G 34 GGC Gly G 0 GGA Gly G 0 GGG Gly G 核糖體蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率： LOGO Case 1. hIFN?2b的表達 hIFN?2b的特點： 1）一級結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用，不需要翻譯后加工 2）經(jīng)過密碼子的改造可以在 LOGO Case 2. HBsAg的表達 HBsAg的特點： 1）高度糖基化 ，即使表達出蛋白質(zhì)也不具備天然蛋白質(zhì)的功能。 2） HBV是真核病毒，因此 HBsAg基因含有。 因此，到目前為止， HBsAg重組疫苗還是在真核 CHO細胞或酵母中表達的。 LOGO 真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢： 1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng) 2. 具翻譯后修飾系統(tǒng)，重組蛋白具有很好的活性 3. 可實現(xiàn)真正的分泌表達 4. 基因治療、研究基因的功能等 原核表達系統(tǒng)的缺點： 1. 沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、剪除內(nèi)含子 2. 缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯的蛋白質(zhì)進一步修飾加工 LOGO 真核細胞 酵母細胞 昆蟲細胞 哺乳動物細胞 酵母表達系統(tǒng) 昆蟲表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞 表達系統(tǒng) 以獲得大量的有活性的蛋白為目的 研究基因或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能為目的 第二部分 .外源基因在真核細胞中的表達 Yeast Insect Mammalian Eukaryotic Expression System LOGO 一、酵母表達系統(tǒng) 系統(tǒng)組成： 酵母細胞 酵母質(zhì)粒表達載體 … 比細菌菌落大而厚，菌落表面光滑濕潤、粘稠、容易挑起， 質(zhì)地、顏色均一， 多為乳白色 *低等真核單細胞生物，生長快，可大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng) , 成本較低。 *可以進行一定程度的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。 ： LOGO 大腸桿菌 /酵母菌穿梭載體 ： 1. 在 *pUC ori , Ampr 2. 在酵母細胞象細菌中質(zhì)粒一樣復(fù)制 （ 2u origin） 3. 在酵母細胞中表達外源基因 *酵母可識別的啟動子 4. 篩選標記： 營養(yǎng)缺陷篩選 URA3 2. 酵母質(zhì)粒表達載體 LOGO 二、昆蟲表達系統(tǒng) 昆蟲病毒： baculovirus 轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒載體 可對蛋白質(zhì)進行 翻譯后加工修飾 可 高水平表達 外源基因產(chǎn)物 操作相對簡單 已經(jīng)商品化 蛋白準確定位 如分泌到膜外。 載體： 昆蟲表達系統(tǒng)的組分： 昆蟲細胞 優(yōu)點： LOGO 病毒基因組相對較 大 ，不宜直接將外源基因克隆到病毒基因組。 the polyhedrin gene bees unnecessary. replace polyhedrin coding seq with gene of interest (G of I) Baculovirus genome strong Promoter Polyhedrin gene 昆蟲病毒 昆蟲表達載體： 提供目的基因的質(zhì)粒載體 昆蟲桿狀病毒 …….. LOGO *首先將外源片段克隆到某質(zhì)粒上，再以某種機制將外源片段遞到病毒基因組上 有兩種不同原理構(gòu)建的昆蟲表達系統(tǒng)： 1）根據(jù) 同源重組 原理構(gòu)建的 2）根據(jù) 轉(zhuǎn)座子 原理構(gòu)建的， 如 BacToBac表達系統(tǒng) 昆蟲表達載體： 提供目的基因的質(zhì)粒載體 LOGO 轉(zhuǎn)座子機制：如 BacToBac表達系統(tǒng) Bacmid insect cell Bacmid Polyhedrin promoter 將轉(zhuǎn)座子的靶點構(gòu)建到昆蟲病毒基因組上 （ Baculovirus plasmid） 帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒， 可在細菌和昆蟲細胞之間穿梭 LOGO 是否還記得轉(zhuǎn)座子是在染色體間運動？ 123456789123456789987654321987654321T r ansp o sase g eneAT G CAT ACG TT a r ge t si teH o st D N Atra ns pos aseAT G CAT ACG Ttra ns pos it iontra ns pos onAT G CAT ACG TAT G CAT ACG T123456789123456789987654321987654321T r a ns po so nT a r ge tr e p e a tsI n v e r te d r e p e a tsI n v e r te d r e p e a tsT a r ge tr e p e a ts轉(zhuǎn)座子 (transposon,Tn)是存在于染色體 DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位?？稍诩毦娜旧w，質(zhì)粒或噬菌體之間自行移動的遺傳成分，是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨立的 DNA序列。 LOGO *將轉(zhuǎn)座子的兩個臂構(gòu)建到 MCS兩側(cè)。 *通過基因克隆的方法將 外源片段 克隆到轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒上。 慶大 Ppolh 真核篩選標記基因 ＋ promoter of Polyhedrin ＋ G of I are flanked with two arms of a transposon. LOGO 2 Rebinant bacmid DNA 主要是 LacZ’ , Kanr , oriE Baculovirus genome pFastBac1 Tn7L Foreign gene Attachment site helper Competent DN10Bac Transformation helper Foreign gene Ppolh containing rebinant Bacmid Ppolh Miniprep of high molecular weight DNA 2. To cons