生化綠色熒光蛋白的基因克隆及表達開題報告-資料下載頁
2025-08-05 09:44本頁面
【正文】 】1. 提取質(zhì)粒加入溶液1渾濁；加入溶液2變澄清；加入溶液3出現(xiàn)白色絮狀沉淀；加入氯仿抽提溶液分層2. 重組質(zhì)粒構(gòu)建的鑒定Lane1：Marker protein(標記蛋白)；Lane 2：含目的基因的重組質(zhì)粒，得到有兩條帶，可知前面第一條帶為GFP基因片段，第二條帶為質(zhì)粒載體，故成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28aGFP。3. PCR檢測結(jié)果PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測，如果可以看到明顯的一條亮帶，則可知eGFP基因成功連接到pET28a載體。如果其前面有不明顯的彌散的條帶，則為引物二聚體。4. IPTG誘導表達分別在日光燈和紫外光下進行照射，如果攜帶重組質(zhì)粒pET28aGFP的大腸桿菌BL21用IPTG誘導表達后呈現(xiàn)綠色，說明含外源基因GFP的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21體內(nèi)成功表達；而沒有經(jīng)IPTG誘導的菌體則不發(fā)出綠色熒光?！居懻摗咳绻亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率不高，其原因可能有以下幾點：（1）生長時期：實驗發(fā)現(xiàn)在對數(shù)中期的大腸桿菌易生感受態(tài)，轉(zhuǎn)化時菌濃度應控制在不超過107個/ml。濃度過高或者過低都會影響轉(zhuǎn)化效率。 （2）CaCl2法0 ℃放置時間的影響：細菌經(jīng)0 ℃ CaCl2處理后轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24 h達到最高，之后轉(zhuǎn)化率逐漸下降。 （3）化合物及無機離子的影響：在鈣離子的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其他二價金屬離子或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍。 （4）質(zhì)粒大小、構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1 ng超螺旋DNA即可使50 ul的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%。 （5）防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在冰浴低溫和無菌條件下進行，所用器皿，如離心管、EP管等均應徹底洗凈，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其他試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 （6）試劑的質(zhì)量：所用的試劑，如CaCl2等均需是最高純度的，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。 （7）42 ℃熱處理時間很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準確，同時注意熱處理過程中離心管不要搖動。 （8）菌液涂平皿操作時，應避免反復來回涂，因為感受態(tài)細胞的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。 在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 細胞后,如果在平皿中用IPTG誘導長出菌苔，但未出現(xiàn)單菌落，可能的原因 ：（1）菌液沒有涂開； （2）涂完后未先正放1h使菌液充分被LB吸收； （3）平皿上有水珠，未除去； （4）搖菌時間過長，菌過多。 【心得體會】 本實驗設計是一個綜合性的，與我們平時實驗經(jīng)歷相比對我們的要求更多更嚴。它主要要求我們形成認真思考的習慣，自己查閱本實驗的相關(guān)文獻，分析本實驗的目的，通過本實驗要達到什么樣的結(jié)果，達到預計的結(jié)果需要通過怎樣的方案實現(xiàn)，根據(jù)實驗需要和自己的相關(guān)了解自己設置適合的實驗方案，增強我們的思維能力和動手能力，同時也使我們的團隊合作精神得到了提高，并學會把我們所學的知識有機的結(jié)合到一起。分 子 生 物 學 設 計 性 實 驗 開 題 報
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