【導(dǎo)讀】蒙古有4種該屬植物是我國內(nèi)蒙古、甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群種之一，討耐鹽機理具有重要的理論意義。鹽脅迫是影響植物正常生長發(fā)育的最嚴(yán)重的非生物脅迫之一。害則包括由土壤鹽分過多引起的滲透脅迫和由離子間的競爭引起的營養(yǎng)虧損。物的耐鹽機制主要包括滲透調(diào)節(jié)和降低胞內(nèi)Na+濃度。減少Na+的吸收、外排Na+. Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)。液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白是將胞質(zhì)內(nèi)的Na+逆Na+. 濃度梯度運送到液泡膜中進而將Na+區(qū)域化集中。過量表達可顯著提高植物的耐鹽性。RT-PCR、RACE技術(shù)及iPCR的方法，從小果白刺中克隆了NHX. 小果白刺的肌動蛋白基因的克隆為今后研究NHX等白刺屬植物的基因

　　

【正文】 膠塊完全熔化 (約 6 8min)。 （ 3） 加 個 Buffer DEA 體積的 BufferDEB，混合均勻 。當(dāng)分離的 DNA 片段小于 400bp 時，加入 1 個凝膠體積的異丙醇 。 （ 4） 吸取步驟 (3)中的混合液，轉(zhuǎn)移到 DNA 制備管 (置于 2ml(試劑盒內(nèi)提供 )離心管 )中， 室溫下靜置 1min， 120xx 轉(zhuǎn) 離心 1min。棄濾液 。 （ 5） 將制備管置回 2ml離心管，加 500μ lBuffer Wl,120xx 轉(zhuǎn) 離心 305，棄濾液 。 （ 6） 將制備管置回 2ml離心管，加 700μ l BufferW2， 120xx 轉(zhuǎn) 離心 305，棄濾液。以同樣的方法再用 700μ lBufferW2 洗滌一次 120xx 轉(zhuǎn) 離心 1min。 （ 7） 將制備管置回 2ml 離心管中， 120xx 轉(zhuǎn)離心 1 min。 （ 8） 將制備管置于潔凈的 105ml 離心管中，室溫干燥 12min，在制備膜中央加2530μ l Eluent（ 65℃預(yù)熱），室溫靜置 1min。 120xx 轉(zhuǎn)離心 1 min 洗脫 DNA。 、 PCR 膠回收產(chǎn)物與 pMD18T 載體的連接 （ 1） 連接體系如下： pMD18T vector PCR 產(chǎn)物 Solution I 5μL Total 10μL （ 2） 將上述混合液輕輕振蕩后短暫離心， 16℃水浴保溫過夜 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 、 pMD18TNHX和 pMD18TAct 轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞 （ 1） 事先將 干式 恒溫 器 的溫度調(diào)到 42℃ ，并取適量的冰塊。 （ 2） 從 80℃ 超低溫冰箱中取出一管 50μl的 DH5α 感受態(tài)細(xì)菌，迅速插入冰中 融化 ，冰浴 10min。 （ 3） 加入 10μl連接好的 pMD18TNHX 及 pMD18TAct 混合溶液，輕輕震蕩后放置到冰上 30min。 （ 4） 輕輕搖勻后插入 42℃ 60s 進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置 35min。 （ 5） 在超凈工作臺中向上述管中加入 890μL SOC 培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕搖勻，然后固定到搖床上 37℃ 震蕩 60min。 （ 6） 3000rpm短暫離心，棄上清，加入 40μl的 2%的 Xgal， 7μl的 20% IPTG 混勻。 （ 7） 在超凈工作臺中 將 上述轉(zhuǎn)化混合溶液，滴到含有 AMP 的固體 LB 平板培養(yǎng)皿中。然后 從酒精中取出玻璃棒，在火上點燃，稍等片刻， 待其冷卻之后，迅速將菌液涂布均勻。 （ 8） 在涂好的培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記， 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng) 。 篩選鑒定 含 重組質(zhì)粒 的菌落 根據(jù) T 載體上 LacZ 基因的α互補原理，藍白斑篩選原理初步鑒定重組質(zhì)粒，選擇 35 個白色菌落做菌落ＰＣＲ鑒定 PCR 反應(yīng)體系如下： Clony 1μL 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL M13M4 primer（ 10μ m） M13RV primer（ 10μ m） rTaq DNA polymerase dd H2O total 20μL 按如下反應(yīng)進行 PCR 反應(yīng) 94℃ 5min 94℃ 30s 50℃ 30s 35 cycle 72℃ 72℃ 7min PCR 結(jié)束后取 5μLPCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為重組質(zhì)粒菌體。 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 克隆基因片段序列的測定 通過菌落 PCR鑒定重組質(zhì)粒，將其菌斑擴大培養(yǎng)， 5mlLB培養(yǎng)基搖菌 200rpm，1618h。待菌液可明顯看到絮狀物時即可，取 1ml菌液添加 20%滅菌甘油后送至invitrogen 公司測序 。 白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白 cDNA 3’末端的快速克隆 （ RACE） 我們采用 TaKaRa 公司的 RNA PCRKit （ AMV） 進行 3’RACE 反應(yīng) ，擴增 cDNA 的 3’末端。 實驗流程如下圖： 圖 TaKaRa 公司的 RNA PCR Kit（ AMV） 3’RACE 反應(yīng)圖解 、 特異引物的設(shè)計 根據(jù)克隆得到的 516bp 的 cDNA 片段，在 靠近 3’端設(shè)計二個正向特異性引物（ NHXGSPF（ 1） ， NHXGSPF（ 2） ），引物序列為： NHXGSPF（ 1） ： 5’ATTTTGCCAGGCACTCAA3’ NHXGSPF（ 2） ： 5’TGCTTGGCGTCATTACTGGA3’ 下游為 試劑盒提供 M13M4 引物， 引物序列為 M4： 5’GTAAAACGACGGCCAGT3’ 、 3’RACE反應(yīng) 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) cDNA 第一鏈的獲得如前文所述，以 cDNA 為模板進行剿式 PCR，擴增 cDNA 3’末端的未知序列。 （ 1） 1st PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)體系： 10XPCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXGSPF（ 2）（ 10μ m） 1μL M13M4（ 10μ m） 1μL cDNA 2μL rTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL 按以下條件進行 PCR 反應(yīng) 94℃ 2min 94℃ 30s 53℃ 1min 35 cycle 72℃ 1min 72℃ 5min （ 2） 2nd PCR 反應(yīng) 以第一次 PCR 產(chǎn)物為模板， NHXGSPF（ 1）作上游引物， M4 為下游引物，擴增目的片段。 PCR 反應(yīng)體系： 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXGSPF（ 1） （ 10μ m） 1μL M13M4（ 10μ m） 1μL PCR 產(chǎn)物 rTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL 按以下條件進行 PCR 反應(yīng) 94℃ 2min 94℃ 30s 50℃ 45s 35 cycle 72℃ 1min 72℃ 5min 反應(yīng)結(jié)束后取 5μL電泳，檢測有無目的條帶。 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) （ 3）將 3’RACE PCR 得到的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到 pMD18T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑選陽性克隆，菌落 PCR 鑒定，送鑒定重組質(zhì)粒菌液 測序（方法如前所述）。 白刺 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 5’末端 的獲得 5’ PCR（ inverse PCR）的方法， iPCR 是擴增已知序列的核心區(qū)邊側(cè)未知序列的有 效手段，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶裂解基因組 DNA，產(chǎn)生不同大小的片段，然后這些片段的末端連接形成環(huán)狀分子，那么在已知片段內(nèi)部設(shè)計的一對特異性引物就能夠擴增出環(huán)上的未知區(qū)。 iPCR 反應(yīng)一般只要有特異條帶就是目的條帶了。 iPCR 實驗流程 如下： CTAB 法提取白刺基因組 DNA 限制性內(nèi)切酶 37℃酶切過夜 回收純化酶切產(chǎn)物 T4DNA 連接酶 16℃連接 5h或過夜 65℃放置 20min 使酶鈍 化 iPCR 反應(yīng) 實驗中首先 對測序獲得的 Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因序列進行限制性內(nèi)切酶分析，最后選取了 Aor51HI 和 ScaI二個內(nèi)切酶 ， ScaI 內(nèi)切酶識別序列是 AGT^ACT 在NHX1基因片段內(nèi)部具有單一酶切位點， Aor51HI內(nèi)切酶識別序列是 AGC^GCT，在 NHX1 基因片段內(nèi)部具有單一酶切位點 ；然后在酶切位點內(nèi)側(cè)靠近 5’端的位置設(shè)計一對 反向 特異性引物 NHXF 和 NHXR，引物序列如下： NHXR 5’TCACCTGGAATCCCGCAT3’ NHXF 5’ ATTTGAACACCAGCTCGGCTTT3’ 、 CTAB 法提取白刺基因組 DNA （ 1） 65℃ 預(yù)熱 6ml2%CTAB 提取緩沖液（加入 %β 巰基乙醇 ）； （ 2）液氮 中 研磨 新鮮 植物組織成粉末狀 ； （ 3） 在研缽中加入預(yù)熱的 CTAB 提取液，解凍后用剪寬了的槍頭移入 10ml 離心管中， 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 干式恒溫器中 65℃孵育 30min，期間每 5min 混勻一次； （ 4）加入 等體積的 酚 氯仿 /異戊醇 （ 25： 24： 1） 并渦旋混 勻 10min， 8000 rpm離心 5min； （ 5）將上清轉(zhuǎn)移至一新 離心管 中，加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1）抽提 10min， 8000 rpm離心 5min，取上清； （ 6）可重復(fù)操作上步驟，直到看不到中 間層； （ 7） 取上清加 1/2 體積的預(yù)冷 5M NaCl和 2/3 體積 預(yù)冷異丙醇， 20℃靜置 40min， （ 8） 4℃ 5000rpm離心 5min，棄上清， 加 500 μL70%乙醇洗沉淀，吹干后用 TE buffer 溶解 DNA。 、 回收純化酶切產(chǎn)物 （ 1）將酶切產(chǎn)物加 TEbuffer 稀釋到 250ｕ l，加入 等體積的 酚 氯仿 /異戊醇 （ 25：24： 1） 并 渦旋混 勻，室溫靜置 1min， 120xxrpm 離心 2min； （ 2）轉(zhuǎn)移上清， 加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1） 渦旋混 勻，室溫靜置 1min， 120xxrpm 離心 2min； （ 3）轉(zhuǎn)移上清，加入 倍體積預(yù)冷無水乙醇， 1/10 體積 3M 醋酸鈉（ pH ），輕輕震蕩混勻， 80℃放置 20min； （ 4） 4℃ 120xxrpm離心 10min， 棄上清，加 500 μL70%乙醇洗沉淀，吹干后 用 ddH2O溶解。 、 酶切反應(yīng)條件 在 離心管中加入下列試劑： 基因組 DNA 3ｕ l 10 buffer 2ｕ l ScaI/Aor51HI 1ｕ l ddH2O 14ｕ l total 20ｕ l 37 酶切過夜 ，取 3ｕ l 酶切產(chǎn)物電泳鑒定。 、 連接酶反應(yīng)條件 在 離心管中加入下列試劑： 酶切的基因組 DNA 3ｕ l 10 T4DNA ligase buffer 1ｕ l T4DNA ligase l ddH2O 6ｕ l total 10ｕ l 16℃連接 5h 或過夜 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 、 iPCR 反應(yīng) 在 離心管中加入下列試劑： 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXF（ 10μ m） 1μL NHXR（ 10μ m） 1μL Ligated genomic DNA