【導(dǎo)讀】蒙古有4種該屬植物是我國(guó)內(nèi)蒙古、甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群種之一，討耐鹽機(jī)理具有重要的理論意義。鹽脅迫是影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的最嚴(yán)重的非生物脅迫之一。害則包括由土壤鹽分過(guò)多引起的滲透脅迫和由離子間的競(jìng)爭(zhēng)引起的營(yíng)養(yǎng)虧損。物的耐鹽機(jī)制主要包括滲透調(diào)節(jié)和降低胞內(nèi)Na+濃度。減少Na+的吸收、外排Na+. Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)。液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是將胞質(zhì)內(nèi)的Na+逆Na+. 濃度梯度運(yùn)送到液泡膜中進(jìn)而將Na+區(qū)域化集中。過(guò)量表達(dá)可顯著提高植物的耐鹽性。RT-PCR、RACE技術(shù)及iPCR的方法，從小果白刺中克隆了NHX. 小果白刺的肌動(dòng)蛋白基因的克隆為今后研究NHX等白刺屬植物的基因

　　

【正文】 膠塊完全熔化 (約 6 8min)。 （ 3） 加 個(gè) Buffer DEA 體積的 BufferDEB，混合均勻 。當(dāng)分離的 DNA 片段小于 400bp 時(shí)，加入 1 個(gè)凝膠體積的異丙醇 。 （ 4） 吸取步驟 (3)中的混合液，轉(zhuǎn)移到 DNA 制備管 (置于 2ml(試劑盒內(nèi)提供 )離心管 )中， 室溫下靜置 1min， 120xx 轉(zhuǎn) 離心 1min。棄濾液 。 （ 5） 將制備管置回 2ml離心管，加 500μ lBuffer Wl,120xx 轉(zhuǎn) 離心 305，棄濾液 。 （ 6） 將制備管置回 2ml離心管，加 700μ l BufferW2， 120xx 轉(zhuǎn) 離心 305，棄濾液。以同樣的方法再用 700μ lBufferW2 洗滌一次 120xx 轉(zhuǎn) 離心 1min。 （ 7） 將制備管置回 2ml 離心管中， 120xx 轉(zhuǎn)離心 1 min。 （ 8） 將制備管置于潔凈的 105ml 離心管中，室溫干燥 12min，在制備膜中央加2530μ l Eluent（ 65℃預(yù)熱），室溫靜置 1min。 120xx 轉(zhuǎn)離心 1 min 洗脫 DNA。 、 PCR 膠回收產(chǎn)物與 pMD18T 載體的連接 （ 1） 連接體系如下： pMD18T vector PCR 產(chǎn)物 Solution I 5μL Total 10μL （ 2） 將上述混合液輕輕振蕩后短暫離心， 16℃水浴保溫過(guò)夜 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 、 pMD18TNHX和 pMD18TAct 轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞 （ 1） 事先將 干式 恒溫 器 的溫度調(diào)到 42℃ ，并取適量的冰塊。 （ 2） 從 80℃ 超低溫冰箱中取出一管 50μl的 DH5α 感受態(tài)細(xì)菌，迅速插入冰中 融化 ，冰浴 10min。 （ 3） 加入 10μl連接好的 pMD18TNHX 及 pMD18TAct 混合溶液，輕輕震蕩后放置到冰上 30min。 （ 4） 輕輕搖勻后插入 42℃ 60s 進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置 35min。 （ 5） 在超凈工作臺(tái)中向上述管中加入 890μL SOC 培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕搖勻，然后固定到搖床上 37℃ 震蕩 60min。 （ 6） 3000rpm短暫離心，棄上清，加入 40μl的 2%的 Xgal， 7μl的 20% IPTG 混勻。 （ 7） 在超凈工作臺(tái)中 將 上述轉(zhuǎn)化混合溶液，滴到含有 AMP 的固體 LB 平板培養(yǎng)皿中。然后 從酒精中取出玻璃棒，在火上點(diǎn)燃，稍等片刻， 待其冷卻之后，迅速將菌液涂布均勻。 （ 8） 在涂好的培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記， 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng) 。 篩選鑒定 含 重組質(zhì)粒 的菌落 根據(jù) T 載體上 LacZ 基因的α互補(bǔ)原理，藍(lán)白斑篩選原理初步鑒定重組質(zhì)粒，選擇 35 個(gè)白色菌落做菌落ＰＣＲ鑒定 PCR 反應(yīng)體系如下： Clony 1μL 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL M13M4 primer（ 10μ m） M13RV primer（ 10μ m） rTaq DNA polymerase dd H2O total 20μL 按如下反應(yīng)進(jìn)行 PCR 反應(yīng) 94℃ 5min 94℃ 30s 50℃ 30s 35 cycle 72℃ 72℃ 7min PCR 結(jié)束后取 5μLPCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否為重組質(zhì)粒菌體。 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 克隆基因片段序列的測(cè)定 通過(guò)菌落 PCR鑒定重組質(zhì)粒，將其菌斑擴(kuò)大培養(yǎng)， 5mlLB培養(yǎng)基搖菌 200rpm，1618h。待菌液可明顯看到絮狀物時(shí)即可，取 1ml菌液添加 20%滅菌甘油后送至invitrogen 公司測(cè)序 。 白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 cDNA 3’末端的快速克隆 （ RACE） 我們采用 TaKaRa 公司的 RNA PCRKit （ AMV） 進(jìn)行 3’RACE 反應(yīng) ，擴(kuò)增 cDNA 的 3’末端。 實(shí)驗(yàn)流程如下圖： 圖 TaKaRa 公司的 RNA PCR Kit（ AMV） 3’RACE 反應(yīng)圖解 、 特異引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)克隆得到的 516bp 的 cDNA 片段，在 靠近 3’端設(shè)計(jì)二個(gè)正向特異性引物（ NHXGSPF（ 1） ， NHXGSPF（ 2） ），引物序列為： NHXGSPF（ 1） ： 5’ATTTTGCCAGGCACTCAA3’ NHXGSPF（ 2） ： 5’TGCTTGGCGTCATTACTGGA3’ 下游為 試劑盒提供 M13M4 引物， 引物序列為 M4： 5’GTAAAACGACGGCCAGT3’ 、 3’RACE反應(yīng) 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) cDNA 第一鏈的獲得如前文所述，以 cDNA 為模板進(jìn)行剿式 PCR，擴(kuò)增 cDNA 3’末端的未知序列。 （ 1） 1st PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)體系： 10XPCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXGSPF（ 2）（ 10μ m） 1μL M13M4（ 10μ m） 1μL cDNA 2μL rTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL 按以下條件進(jìn)行 PCR 反應(yīng) 94℃ 2min 94℃ 30s 53℃ 1min 35 cycle 72℃ 1min 72℃ 5min （ 2） 2nd PCR 反應(yīng) 以第一次 PCR 產(chǎn)物為模板， NHXGSPF（ 1）作上游引物， M4 為下游引物，擴(kuò)增目的片段。 PCR 反應(yīng)體系： 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXGSPF（ 1） （ 10μ m） 1μL M13M4（ 10μ m） 1μL PCR 產(chǎn)物 rTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL 按以下條件進(jìn)行 PCR 反應(yīng) 94℃ 2min 94℃ 30s 50℃ 45s 35 cycle 72℃ 1min 72℃ 5min 反應(yīng)結(jié)束后取 5μL電泳，檢測(cè)有無(wú)目的條帶。 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) （ 3）將 3’RACE PCR 得到的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后連接到 pMD18T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑選陽(yáng)性克隆，菌落 PCR 鑒定，送鑒定重組質(zhì)粒菌液 測(cè)序（方法如前所述）。 白刺 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 5’末端 的獲得 5’ PCR（ inverse PCR）的方法， iPCR 是擴(kuò)增已知序列的核心區(qū)邊側(cè)未知序列的有 效手段，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶裂解基因組 DNA，產(chǎn)生不同大小的片段，然后這些片段的末端連接形成環(huán)狀分子，那么在已知片段內(nèi)部設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物就能夠擴(kuò)增出環(huán)上的未知區(qū)。 iPCR 反應(yīng)一般只要有特異條帶就是目的條帶了。 iPCR 實(shí)驗(yàn)流程 如下： CTAB 法提取白刺基因組 DNA 限制性內(nèi)切酶 37℃酶切過(guò)夜 回收純化酶切產(chǎn)物 T4DNA 連接酶 16℃連接 5h或過(guò)夜 65℃放置 20min 使酶鈍 化 iPCR 反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)中首先 對(duì)測(cè)序獲得的 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析，最后選取了 Aor51HI 和 ScaI二個(gè)內(nèi)切酶 ， ScaI 內(nèi)切酶識(shí)別序列是 AGT^ACT 在NHX1基因片段內(nèi)部具有單一酶切位點(diǎn)， Aor51HI內(nèi)切酶識(shí)別序列是 AGC^GCT，在 NHX1 基因片段內(nèi)部具有單一酶切位點(diǎn) ；然后在酶切位點(diǎn)內(nèi)側(cè)靠近 5’端的位置設(shè)計(jì)一對(duì) 反向 特異性引物 NHXF 和 NHXR，引物序列如下： NHXR 5’TCACCTGGAATCCCGCAT3’ NHXF 5’ ATTTGAACACCAGCTCGGCTTT3’ 、 CTAB 法提取白刺基因組 DNA （ 1） 65℃ 預(yù)熱 6ml2%CTAB 提取緩沖液（加入 %β 巰基乙醇 ）； （ 2）液氮 中 研磨 新鮮 植物組織成粉末狀 ； （ 3） 在研缽中加入預(yù)熱的 CTAB 提取液，解凍后用剪寬了的槍頭移入 10ml 離心管中， 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 干式恒溫器中 65℃孵育 30min，期間每 5min 混勻一次； （ 4）加入 等體積的 酚 氯仿 /異戊醇 （ 25： 24： 1） 并渦旋混 勻 10min， 8000 rpm離心 5min； （ 5）將上清轉(zhuǎn)移至一新 離心管 中，加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1）抽提 10min， 8000 rpm離心 5min，取上清； （ 6）可重復(fù)操作上步驟，直到看不到中 間層； （ 7） 取上清加 1/2 體積的預(yù)冷 5M NaCl和 2/3 體積 預(yù)冷異丙醇， 20℃靜置 40min， （ 8） 4℃ 5000rpm離心 5min，棄上清， 加 500 μL70%乙醇洗沉淀，吹干后用 TE buffer 溶解 DNA。 、 回收純化酶切產(chǎn)物 （ 1）將酶切產(chǎn)物加 TEbuffer 稀釋到 250ｕ l，加入 等體積的 酚 氯仿 /異戊醇 （ 25：24： 1） 并 渦旋混 勻，室溫靜置 1min， 120xxrpm 離心 2min； （ 2）轉(zhuǎn)移上清， 加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1） 渦旋混 勻，室溫靜置 1min， 120xxrpm 離心 2min； （ 3）轉(zhuǎn)移上清，加入 倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇， 1/10 體積 3M 醋酸鈉（ pH ），輕輕震蕩混勻， 80℃放置 20min； （ 4） 4℃ 120xxrpm離心 10min， 棄上清，加 500 μL70%乙醇洗沉淀，吹干后 用 ddH2O溶解。 、 酶切反應(yīng)條件 在 離心管中加入下列試劑： 基因組 DNA 3ｕ l 10 buffer 2ｕ l ScaI/Aor51HI 1ｕ l ddH2O 14ｕ l total 20ｕ l 37 酶切過(guò)夜 ，取 3ｕ l 酶切產(chǎn)物電泳鑒定。 、 連接酶反應(yīng)條件 在 離心管中加入下列試劑： 酶切的基因組 DNA 3ｕ l 10 T4DNA ligase buffer 1ｕ l T4DNA ligase l ddH2O 6ｕ l total 10ｕ l 16℃連接 5h 或過(guò)夜 內(nèi)蒙古 大學(xué)本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計(jì) ) 、 iPCR 反應(yīng) 在 離心管中加入下列試劑： 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXF（ 10μ m） 1μL NHXR（ 10μ m） 1μL Ligated genomic DNA