生化綠色熒光蛋白的基因克隆及表達開題報告-在線瀏覽
2024-09-15 09:44本頁面
【正文】 體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達。 實驗題目包含的內(nèi)容 本實驗的目的是通過BamH I和Not I兩種限制性內(nèi)切酶的消化把EGFP基因從pEGFPN3質(zhì)粒中克隆出來，或者用PCR方法把EGFP基因從pEGFP—N3質(zhì)粒中擴增出來。表達了GFP的菌體在離心管中則會呈黃綠色，在紫外光激發(fā)下發(fā)射出特異的綠色熒光，從而證明了目的蛋白的表達是否成功?！靖鶕?jù)現(xiàn)有的知識和技能來設(shè)計進行實驗】：? pEGFPN3質(zhì)粒編碼野生型GFP的紅移(熒光波長較大)變異體蛋白，具有更強的熒光(在485nm激發(fā)下比野生型強35倍)和在哺乳動物細胞中有較好的表達。 ? pET28a質(zhì)粒載體上面攜帶一個Nterminal His Tag／Thrombin／T7 tag結(jié)構(gòu)以及一個可以選擇的Cterminal HisTag。 ，確定兩種途徑可以到達目標 第一種方法：用限制性內(nèi)切酶方法，如果選定內(nèi)切酶的方式去做實驗，如何選擇內(nèi)切酶，選哪種內(nèi)切酶即合用又經(jīng)濟。使用Notl酶，Bamhl酶，這是一對最合適的內(nèi)切酶。如果用PCR方法去做實驗，必需根據(jù)pEGFP的序列設(shè)計引物。 類似于DNA的 天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 PCR 技術(shù)是Kary Mullis 在1985 年建立起來的在細胞體外合成DNA 的一種方法。端限定的特異性片段形成指數(shù)式積累?！緟⒖嘉墨I】[1] 梁國棟. 最新分子生物學(xué)實驗技術(shù)[ M] . 北京: 科學(xué)技術(shù)出版社, 2001, 174.[2] 賈艷華，李國勛，張杰 熒光蛋白及其應(yīng)用[3] 魏春紅，李毅主編 聚合酶鏈反應(yīng)PCR 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù) 高等教育出版社，:4546【研究方案】通過分別將DH5α (pEGFPN3)和DH5α(pET28a)提取質(zhì)粒、酶切并連接形成重組質(zhì)粒pET28aGFP， DH5α感受態(tài)細胞中進行轉(zhuǎn)化,通過限制性核酸內(nèi)切酶Not I與Bam H1和PCR對所建質(zhì)粒進行分析鑒定后, 通過轉(zhuǎn)化的方法把含綠色熒光蛋白（GFP）外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體BL21內(nèi)進行表達，再用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達，根據(jù)觀察是否可以看到顯現(xiàn)綠色，判斷GFP基因是否在大腸桿菌中成功表達。 DH5a、表達菌BL21，質(zhì)粒 pET28a 和 pEGFPN3，引物，限制性內(nèi)切酶 Bam H Not Ⅰ。2) 將分別接種過夜菌：LB按1:50的比例接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)2～3 h至OD=～ 。棄上清液， mol/L CaCl2緩和懸菌。4) 棄上清液， mol/L CaCl2（含15%甘油）緩和懸菌，放在－20 ℃冰箱內(nèi)保存。2) 加入2 μl酶連產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置1030 min。4) 加入200 μl LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，50100 rpm振蕩培養(yǎng)1 h。4. 堿法提質(zhì)粒1）感受態(tài)細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，平皿內(nèi)有但菌落長出。3) ml 培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4 ℃、11000 r/min 離心1分鐘，吸棄上清。5) 加入200 ml新配制的溶液 Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，冰上放置5分鐘。7) 用微量離心機于4 ℃、
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