目的基因的克隆ppt課件-資料下載頁
2025-05-01 22:17本頁面
【正文】 的單元操作 化學(xué)合成 DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去 ， 每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng) ， 包括： 基團(tuán)保護(hù) 、分離 、 縮合 、 分離 、 去保護(hù) 五大操作單元 。 從反應(yīng)機(jī)理上來講， DNA化學(xué)合成有 磷酸二酯法 、 磷酸三酯法 、 亞磷酸液三酯法 ；具體操作過程又有 液相合成 和 固相合成 兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便， DNA合成儀就是根據(jù) 固相亞磷酸液三酯法 原理設(shè)計(jì)的 DNA化學(xué)合成的用途 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素 如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 基因等 E 鳥槍法 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 鳥槍法操作的改進(jìn) 鳥槍法克隆目的基因的局限性 ? 鳥槍法 (Shotgun)? . 序列組裝原理 :直接從已測(cè)序的小片段中尋找彼此重疊的測(cè)序克隆 ,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸 . 優(yōu)點(diǎn) :不需預(yù)先了解任何基因組的情況 . A B C A B C 小片段測(cè)序 計(jì)算機(jī)拼裝 DNA的鳥槍法測(cè)序的主要步驟 ? 第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為 2kb左右的基因組文庫。 ? 第二，高效、大規(guī)模的末端測(cè)序。 ? 第三，序列集合。 ? 第四，填補(bǔ)缺口。 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組 DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的 目的重組子 ，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 染色體 DNA的切斷 超聲波處理： 片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部分酶切： 片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載 體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá) 的受體細(xì)胞 篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立） 鳥槍法操作的改進(jìn) 使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體 DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中 目的重組子 的出現(xiàn)頻率 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體 DNA 鳥槍法操作的改進(jìn) 例如，已知某目的基因位于 kb的 SalI片段中，將染色體 DNA用 SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收 DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接 在連接前將 DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離 kb kb kb 鳥槍法操作的改進(jìn) 凍融法 濾紙法 吸附法 低融點(diǎn)凝膠法 溶解法 凝膠 DNA片段回收技術(shù) 透析袋電洗脫 ： 切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳， DNA出膠后進(jìn)行抽提 DNA回收。 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠： 切下膠，加熱到 65℃ 熔化膠，然后抽提回收 DNA。 方法：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。 玻璃珠洗脫法 ： 將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結(jié)合 DNA， 經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將 DNA洗脫下。 瓊脂水解酶： 將含 DNA的凝膠進(jìn)行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA， 后使用酚抽提方法回收 DNA 鳥槍法克隆目的基因的局限性 工作量較大 ， 需要了解目的基因的背景知識(shí) 不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)
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