目的基因的克隆ppt課件-展示頁
2025-05-10 22:17本頁面
【正文】 使用 PCR技術克隆目的基因的 前提條件 是： 已知待擴增目的基因或 DNA片段兩側的序列， 根據(jù)該序列化學合成聚合反應所需的雙引物 1. PCR法定向擴增目的基因的基本原理 5‘ 5‘ 目的基因 5‘ 變性 加熱 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加熱 變性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加熱 變性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 由 Taq DNA聚合酶擴增的 PCR產(chǎn)物中，其 3’ 末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是 A， 因為 Taq DNA聚合酶對 dATP具有優(yōu)先聚合活性。 基因工程或 DNA重組技術三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后， 或確定其表達調控機制和生物學功能， 或建立高效表達系統(tǒng)，構建具有經(jīng)濟價值的基因工程菌（細胞） 或將目的基因在體外進行必要的結構功能修飾，然后輸回細胞內改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 5 目的基因的獲得 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類： 一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??； 另一類是利用 PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取 TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的 T載體 克隆 2. PCR克隆目的基因的基本程序 5’ 5’ A A T T 5’ 5’ PCR擴增產(chǎn)物 T 載體 T7 lacZ MCS ori Apr 3. PCR盒式引物擴增法 染色體 DNA Sau3A部分酶切 加裝盒式接頭片段 5‘ 端不含磷酸基團 變性 引物退火 擴增 B 基因文庫的構建 基因文庫的基本概念 基因文庫的構建程序 基因組文庫重組克隆的排序 基因文庫的基本概念 基因庫與基因文庫 基因庫（ gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（ gene library or gene bank） 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式 基因組文庫 （含有全部基因） 存在（人工構建）。很顯然， cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫 基因文庫的基本概念 基因文庫的完備性 基因文庫的 完備性 是指：在構建的基因文庫中任一基因存在的概 率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù) N之間的關系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕? f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 例如，人的單倍體 DNA總長為 x 109 bp， 基因文庫中克隆片段 的平均大小為 15 kb， 則構建一個完備性為 基因文庫至少需要 45萬個克??；而當完備性提高到 ，基因文庫至少需要 180 萬個克隆 基因文庫的基本概念 基因文庫的質量標準 除了盡可能高的 完備性外， 一個理想的基因文庫應具備下列條件： 重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力 載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆 克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序 克隆片段易于從載體分子上完整卸下 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選 基因文庫的構建程序 基因組 DNA的制備 為了最大限
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