目的基因的克隆ppt課件(參考版)
2025-05-04 22:17本頁面
【正文】 玻璃珠洗脫法 ： 將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結合 DNA， 經分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將 DNA洗脫下。 低熔點瓊脂糖凝膠： 切下膠，加熱到 65℃ 熔化膠，然后抽提回收 DNA。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 染色體 DNA的切斷 超聲波處理： 片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載 體；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為 轉化受體細胞 受體細胞；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達 的受體細胞 篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的建立） 鳥槍法操作的改進 使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。 ? 第四，填補缺口。 ? 第二，高效、大規(guī)模的末端測序。 從反應機理上來講， DNA化學合成有 磷酸二酯法 、 磷酸三酯法 、 亞磷酸液三酯法 ；具體操作過程又有 液相合成 和 固相合成 兩種形式。若將雜交陽性結果記為 ? 1?，而陰性結果記為 ? 0? ，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序 隨機探針聯合雜交法 C cDNA法 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 cDNA法分離目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性 cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 mRNA cDNA第一鏈的合成 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一鏈 引物 退火 逆轉錄酶 dNTPs cDNA第二鏈的合成 煮沸 NaOH 自身引導法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端會有幾對堿基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPs RNaesH 置換合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端也會有幾對堿基缺失 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4DNA ligase cDNA第二鏈的合成 dCTP TdT 引導合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列 5‘ ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs Terminal deoxynucleotidyl t
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1