【正文】 慶大 Ppolh 真核篩選標(biāo)記基因 ＋ promoter of Polyhedrin ＋ G of I are flanked with two arms of a transposon. LOGO 2 Rebinant bacmid DNA 主要是 LacZ’ , Kanr , oriE Baculovirus genome pFastBac1 Tn7L Foreign gene Attachment site helper Competent DN10Bac Transformation helper Foreign gene Ppolh containing rebinant Bacmid Ppolh Miniprep of high molecular weight DNA 2. To construc。 LOGO *將轉(zhuǎn)座子的兩個(gè)臂構(gòu)建到 MCS兩側(cè)。 the polyhedrin gene bees unnecessary. replace polyhedrin coding seq with gene of interest (G of I) Baculovirus genome strong Promoter Polyhedrin gene 昆蟲病毒 昆蟲表達(dá)載體： 提供目的基因的質(zhì)粒載體 昆蟲桿狀病毒 …….. LOGO *首先將外源片段克隆到某質(zhì)粒上，再以某種機(jī)制將外源片段遞到病毒基因組上 有兩種不同原理構(gòu)建的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)： 1）根據(jù) 同源重組 原理構(gòu)建的 2）根據(jù) 轉(zhuǎn)座子 原理構(gòu)建的， 如 BacToBac表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲表達(dá)載體： 提供目的基因的質(zhì)粒載體 LOGO 轉(zhuǎn)座子機(jī)制：如 BacToBac表達(dá)系統(tǒng) Bacmid insect cell Bacmid Polyhedrin promoter 將轉(zhuǎn)座子的靶點(diǎn)構(gòu)建到昆蟲病毒基因組上 （ Baculovirus plasmid） 帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒， 可在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞之間穿梭 LOGO 是否還記得轉(zhuǎn)座子是在染色體間運(yùn)動？ 123456789123456789987654321987654321T r ansp o sase g eneAT G CAT ACG TT a r ge t si teH o st D N Atra ns pos aseAT G CAT ACG Ttra ns pos it iontra ns pos onAT G CAT ACG TAT G CAT ACG T123456789123456789987654321987654321T r a ns po so nT a r ge tr e p e a tsI n v e r te d r e p e a tsI n v e r te d r e p e a tsT a r ge tr e p e a ts轉(zhuǎn)座子 (transposon,Tn)是存在于染色體 DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。 ： LOGO 大腸桿菌 /酵母菌穿梭載體 ： 1. 在 *pUC ori , Ampr 2. 在酵母細(xì)胞象細(xì)菌中質(zhì)粒一樣復(fù)制 （ 2u origin） 3. 在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源基因 *酵母可識別的啟動子 4. 篩選標(biāo)記： 營養(yǎng)缺陷篩選 URA3 2. 酵母質(zhì)粒表達(dá)載體 LOGO 二、昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲病毒： baculovirus 轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒載體 可對蛋白質(zhì)進(jìn)行 翻譯后加工修飾 可 高水平表達(dá) 外源基因產(chǎn)物 操作相對簡單 已經(jīng)商品化 蛋白準(zhǔn)確定位 如分泌到膜外。 LOGO 真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢： 1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng) 2. 具翻譯后修飾系統(tǒng)，重組蛋白具有很好的活性 3. 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá) 4. 基因治療、研究基因的功能等 原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)： 1. 沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、剪除內(nèi)含子 2. 缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工 LOGO 真核細(xì)胞 酵母細(xì)胞 昆蟲細(xì)胞 哺乳動物細(xì)胞 酵母表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞 表達(dá)系統(tǒng) 以獲得大量的有活性的蛋白為目的 研究基因或其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能為目的 第二部分 .外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) Yeast Insect Mammalian Eukaryotic Expression System LOGO 一、酵母表達(dá)系統(tǒng) 系統(tǒng)組成： 酵母細(xì)胞 酵母質(zhì)粒表達(dá)載體 … 比細(xì)菌菌落大而厚，菌落表面光滑濕潤、粘稠、容易挑起， 質(zhì)地、顏色均一， 多為乳白色 *低等真核單細(xì)胞生物，生長快，可大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng) , 成本較低。 2） HBV是真核病毒，因此 HBsAg基因含有。 真核基因 原核基因 斷裂 基因 連續(xù) 基因 采用 RTPCR法 LOGO （ 2）盡量將密碼子改變成 ，如果有困難，可嘗試將基因 5’端前 50個(gè)堿基變成偏愛密碼子。 Protein of interest with a small additional peptide at N or C end. Fig. A schematic structure of fusion protein 2) 融合型表達(dá)載體 LOGO Most popular prokaryotic expression plasmid with histag. 融合型表達(dá)載體 舉例 LOGO 融合蛋白 Niaffinity chromatography if the fused is 6his Ni Ni Hishishishishishis Ionic bond Histag Protein 可以加入蛋白酶切位點(diǎn) His taq His taq TAA NcoI (ATG) EcoRI HindIII 離子鍵 親和層析 LOGO 外源蛋白以融合蛋白的形式表達(dá) , 讀碼框架固定或可選擇 特點(diǎn)： 小結(jié) : 融合型表達(dá)載體 ?表達(dá)效率高 ?產(chǎn)物穩(wěn)定 ?易純化：利用融合原核多肽的特性 Fusion protein can be purified easily ? Can be made in large amounts. 優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)： 非天然蛋白，需要表達(dá)后切除融合蛋白 LOGO 3)分泌型表達(dá)載體 Secretion expression vectors ATG下游構(gòu)建了信號肽基因序列 Secreted into medium?(!!) can not do that LOGO Cell wall Cytoplasmic membrane Genome 分泌到細(xì)胞周間隙中的重組蛋白質(zhì) Rebinant protein ? the space between cell membrane and cell wall. LOGO ? The rebinant protein will be secreted into periplasm ?避免目的蛋白被細(xì)菌蛋白酶降解 ? The high expression level ?利于收集外源蛋白 優(yōu)點(diǎn)： 讀碼框架固定 : The target gene does not need start codon because it uses the ATG of signal peptide. 特點(diǎn)： LOGO Single colony 50 ml LB medium for 5 hours. OD= induce foreign gene expression in host. transform rebinant plasmid into expression host cell (BL21DE3) 轉(zhuǎn)化平板 R eb inan t P rotein細(xì)菌處于對數(shù)生長期時(shí) 擴(kuò)大培養(yǎng) 留種，然后 1/100接種。 IPTG:類乳糖誘導(dǎo)劑 “O”持續(xù)開放 培養(yǎng)基 葡萄糖耗盡 “P”開放 pET vectors and BL(DE3) inducible system (Novagen) LOGO 終止子： 強(qiáng)終止子、二聚體終止子 轉(zhuǎn)錄過度的危害： 影響目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率 干擾基因載體的復(fù)制等生物學(xué)功能 增加受體細(xì)胞的無效能量消耗 啟動子 終止子 SD mRNA LOGO NNNAAGGAGG NNNNNAUG CAA AUU SD 與 16S rRNA 3’富含嘧啶的堿基互補(bǔ)配對 ,對蛋白質(zhì)翻譯的起始非常重要 ! 3~9 nt 311 nt SD序列 : 原核 mRNA具有獨(dú)特的 SD序列 , 是核糖體結(jié)合位點(diǎn) . (ribosome binding site, RBS) LOGO SD序列：影響翻譯效率 SD序列與 16SrRNA的互補(bǔ)性 SD與起始密碼子之間的距離 LOGO 成熟型 融合型 分泌型 減少原核細(xì)胞對外源蛋白的降解 天然完整蛋白 融合蛋白 分泌性蛋白 原核表達(dá)質(zhì)粒的類型： LOGO 1）成熟型表達(dá)載體 ori promoter SD MCS Expression vector 特點(diǎn)： ?外源基因需攜帶 ATG和TAA ?只表達(dá)目的基因編碼的氨基酸 ?產(chǎn)生天然蛋白，容易被降解，因此 產(chǎn)量小 ，也可能不穩(wěn)定。 受 λ噬菌體 CI基因調(diào)控