【正文】 1983年改造的pGV3850 需要同源重組才能插入外源基因。 ① pGV3850的特點(diǎn)： 是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于 pBR322質(zhì)粒作為中間載體。 宿主土壤農(nóng)桿菌的選擇標(biāo)記是位于中間載體 pBR322上的 卡那霉素抗性 （ Kanr）基因。 位于 TDNA右半部分的 胭脂堿合成酶 基因（ nos）。 1）膿桿菌選擇標(biāo)記 2）最終受體植物的選擇標(biāo)記 ② 選擇標(biāo)記 卡那霉素抗性 （ Kanr ）基因（卡那霉素對植物有劇毒！） ③ 外源基因插入pGV3850的過程 外源基因 Kanr pBR322 土壤農(nóng)桿菌 含 pGV3850 植物組織 卡那霉素篩選 胭脂堿篩選 抗卡那霉素 的土壤農(nóng)桿菌 外源基因 表達(dá)鑒定 轉(zhuǎn)化 插入 感染 pBR322與pGV3850重組 整合到 染色體上 pBR322不能在土壤農(nóng)桿菌中復(fù)制，只能同pGV3850重組。只有這樣， 土壤農(nóng)桿菌才能得到抗卡那霉素性狀。 轉(zhuǎn)化后可誘導(dǎo)愈傷組織分化成轉(zhuǎn)基因植物 （ 2）雙元載體（ binary vectors） 既有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)也有農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)，是個 穿梭載體 。 Ti質(zhì)粒被剔除了 TDNA、冠癭堿代謝基因、 vir基因。 大幅度減小質(zhì)粒的體積。（ 10kb） ① 雙元載體的結(jié)構(gòu) Ti的精髓： Vir基因（轉(zhuǎn)移）和左右界（整合） ② 雙元載體的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，所有的克隆步驟都在大腸桿菌里操作。 受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套 vir基因（但缺失 TDNA及左右邊界）的 “ 幫助質(zhì)粒 ” 提供 vir產(chǎn)物。 1）基因插入 2） 幫助質(zhì)粒 （ helper plasmid） Vir產(chǎn)物使雙元載體上的 TDNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞，并整合到植物染色體上。 左 右 外源基因 雙元載體 Vir 幫助質(zhì)粒 農(nóng)桿菌 Vir 農(nóng)桿菌 左 右 外源基因 感染植物 轉(zhuǎn)化 左 右 外源基因 進(jìn)入植物細(xì)胞核，整合，表達(dá) （ 3）三親融合法 (triparental matig) 含雙元載體的大腸桿菌： 含有 外源基因 和 左右邊界 。 含有幫助質(zhì)粒的輔助細(xì)菌： 含 vir基因 。 受體農(nóng)桿菌（空）： 三種菌混合培養(yǎng)，然后通過各自的抗菌素抗性標(biāo)記選擇吸收了 外源基因、左右界、和 Vir的農(nóng)桿菌。 三親 四、在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá) SV40病毒 常用的 SV40載體，是從猿猴空泡病毒SV40（ simian vacuolating virus40）改造而來的。 ① 20面體外殼： 由 VP VP2和 VP3三種病毒外殼蛋白構(gòu)成。 5243bp的環(huán)狀雙鏈。 ② DNA： （ 1） SV40病毒的結(jié)構(gòu) SV40 猿猴細(xì)胞 細(xì)胞裂解 釋放 SV40 嚙齒類細(xì)胞 細(xì)胞癌變 SV40DNA整合到寄主染色體上 permissive nonpermissive （ 2） SV40感染和生存方式 T抗原（ tumor antigen） : 兩個 6聚體的 T抗原結(jié)合在 SV40 DNA的復(fù)制起始點(diǎn)上，分別向相反方向移動，將雙鏈 DNA解螺旋。 隨后單鏈 DNA結(jié)合蛋白（ ssB）與解開的單鏈 DNA結(jié)合維持解旋狀態(tài)。 (3) SV40 DNA的復(fù)制 ① 解鏈 SV40編碼的蛋白。功能是在 SV40 DNA復(fù)制的時候解開 DNA雙鏈。 T抗原 SV40 DNA雙鏈 ② SV40 復(fù)制起始位點(diǎn) 5’CTCACTACTTCTGGAATAGC 3’GAGTGATGAAGACCTTATCG 1 20 早期回文序列 TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCT AGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA 21 47 T抗原結(jié)合位點(diǎn) GCATAAATAAAAAAAATTAGTC CGTATT TATTTT TTTTAATCAG 富含 AT區(qū) 48 69 ① 早期表達(dá)區(qū)： (4) SV40病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯 編碼大 T抗原 （控制DNA復(fù)制）和小 t抗原 。 ② 晚期表達(dá)區(qū)： 在 DNA復(fù)制一段時間后表達(dá)，產(chǎn)物是 VPVP2和 VP3三種外殼蛋白 。 對非受納細(xì)胞（ non permissive cells），只有T 抗原表達(dá)，隨后病毒基因組隨機(jī)整合到宿主染色體上。 SV40 整合 (5) SV40病毒的整合 有嚴(yán)格的包裝限制 。如果插入的外源基因過大，就無法包裝。 (6) SV40病毒的包裝 ① 去掉一部分 DNA(T抗原或者 VP基因）。 ② 助手型 SV40 去掉 T抗原基因的病毒， 保留晚期復(fù)制啟動子 。 提供外殼蛋白。 (7) SV40基因組的改造 不能復(fù)制，但能包裝。 需要這兩種缺陷型病毒混合感染，才能互補(bǔ)。既能使插入 SV40的外源基因復(fù)制，又能使外源基因被包裝進(jìn)病毒顆粒，得以擴(kuò)增。 去掉 VP基因，插入 外源基因 的病毒， 保留早期表達(dá)啟動子 。不能包裝，但能復(fù)制。 ③ 重組型 SV40 ④ 包裝重組型 SV40 提供重組 DNA和 T抗原 。 助手型 SV40: 提供 VP外殼蛋白。 重組型 SV40： 提供 T抗原。 包裝成的病毒顆粒中， 既有含外源基因的重組型 ，又有助手型 DNA。 (8) SV40混合傳染過程 感染細(xì)胞，整合 用復(fù)制起點(diǎn)有缺陷的 SV40病毒侵染的猴細(xì)胞株 CV1得到的。所以稱 COS（ CV1， Origin, SV40） 病 毒不能復(fù)制，但能產(chǎn)生 T抗源（類似重組型SV40）。 DNA整合到猴染色體上。所以 COS細(xì)胞中只有 T抗原，無游離的 SV40DNA。 (9) COS細(xì)胞 ① COS細(xì)胞的特點(diǎn)： 有 SV40的 T抗原 。有利于 SV40來源的載體復(fù)制 ② 利用COS細(xì)胞擴(kuò)增外源基因 只保留 SV40的 復(fù)制起始區(qū) （ ori）、早期區(qū)域（ T抗原）的 啟動子、 Poly A化位置以及 t抗原的內(nèi)含子。如 pSV2: a區(qū) : 1323bp， SV40的 復(fù)制起始區(qū)、 T抗原啟 動子、轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 。 b區(qū)： 3243369bp， pBR322的 復(fù)制起始區(qū)、 氨芐青霉素抗性 基因。 c區(qū)： 33704217bp， t抗原內(nèi)含子（拼接信 號）、 Poly A化位置 。 d區(qū)：外源基因插入位置。 (10) SV40 DNA載體 電刺激或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法送入動物細(xì)胞。 ?不需要包裝，可插入 10kb以上的外源基因。 ?既能在大腸桿菌中增殖，又能轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞。 ?受感染的動物細(xì)胞不會裂解，能建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。 pSV2的特點(diǎn)： ?不能在猴細(xì)胞中復(fù)制（沒有 T抗原）。 ?在哺乳動物中存在的途徑是整合到染色體上。 GPT： GlutamicPyruvic Transferase（谷氨酸 丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 ） pcDNA3 Invitrogen Corporation CAT： chloramphenicol acetyl transferase（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶）（用于分析表達(dá)量） 2. 人乳多空 BK病毒載體 人乳多空 BK病毒（ human papova BK virus）能以多拷貝（多于 500拷貝）的染色體外雙鏈DNA形式在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中持續(xù)存在多代。 （ 1）構(gòu)建穿梭載體 ① 刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因。 ② 把病毒復(fù)制功能的基因插入到大腸桿菌 質(zhì)粒中。 ③ 加入 SV40的新霉素抗性基因 Neor。 ④ 加入一個受細(xì)胞色素 P450 dioxin誘導(dǎo)的增強(qiáng)子（ doxinresponsive enhancer， DRE）。 ⑤加入一個 DRE調(diào)控的小鼠乳腺癌啟動子（ MMTP）。 TCDD（ 2，3， 7， 8tetrachlorodibenzopdoxin）誘導(dǎo)表達(dá)。 基因工程總結(jié) 目的基因的獲得 載體的提純 重組載體的構(gòu)建 (酶切 /連接） 轉(zhuǎn)化 /轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 /轉(zhuǎn)染 宿主細(xì)胞的培養(yǎng) 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 一翻譯解釋 gene library. RTPCR antiterminator tumor inducing plasmid 問答題： ，你想將擬南芥中的一個序列已知、編碼單體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物 ? CDNA文庫構(gòu)建過程。 CDNA文庫與基因組文庫得差別。 P177: